[發(fā)明專利]一株脅迫條件下低蛋白酶A外泌的酵母菌株有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410720237.7 | 申請日： | 2014-12-02 |
| 公開（公告）號： | CN104630080B | 公開（公告）日： | 2018-10-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳葉福;肖冬光;韓月然;郭學(xué)武;董健;張翠英;杜麗平;馬立娟 | 申請（專利權(quán)）人： | 天津科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12N1/16 | 分類號： | C12N1/16;C12N15/81;C12C11/00;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/865 |
| 代理公司： | 北京鼎佳達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348 | 代理人： | 王偉鋒 |
| 地址： | 300457 天津市濱*** | 國省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 脅迫 條件下 蛋白酶 酵母 菌株 | ||
1.一種低分泌蛋白酶A釀酒酵母菌株在高泡沫穩(wěn)定性啤酒發(fā)酵過程中向胞外低分泌蛋白酶A中的用途，其特征在于，所述菌株通過在出發(fā)菌株中僅過表達液泡分選受體的VPS10基因全序列獲得；
所述出發(fā)菌株為模式菌W303-1A；
所述VPS10基因其Gene ID為：852264；
所述啤酒發(fā)酵采用氮缺乏的麥汁。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述低分泌蛋白酶A釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法包括如下步驟：
(1)將pPGK1質(zhì)粒上的強啟動子PGK1p-終止子PGK1t片段插入到Y(jié)EP352表達載體上，再將VPS10基因插入到啟動子PGK1p和終止子PGK1t之間，最后將KanMX抗性標記插入表達質(zhì)粒；
(2)將重組表達質(zhì)粒導(dǎo)入到出發(fā)菌株中,得到過表達VPS10的重組菌株WGV10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，低分泌蛋白酶A釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法包括如下步驟：
(1)Yep-PVK質(zhì)粒的構(gòu)建
①以pPGK1質(zhì)粒為模板，PCR擴增出強啟動子PGK1p-終止子PGK1t基因片段；
②以酵母出發(fā)菌株W303-1A總DNA為模板，PCR擴增出VPS10基因；
③以pUC6質(zhì)粒為模板，PCR擴增出KanMX抗性基因；
將PCR產(chǎn)物依次連接到Y(jié)EP352表達載體上，得到重組質(zhì)粒Yep-PVK；
(2)VPS10過表達菌株的構(gòu)建
將游離過表達質(zhì)粒Yep-PVK通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到出發(fā)菌株W303-1A中，得到VPS10游離過表達重組菌株。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，檢測低分泌蛋白酶A釀酒酵母菌株方法是以重組菌株的總DNA為模板，通過引物對：
上游引物：TAACTGATCTATCCAAAACTGAA
下游引物：GCTTATAGTAACGGAGGTGTCTT
進行PCR擴增，可獲得一條長度為1681bp的特異性條帶，所述特異性條帶核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
出現(xiàn)上述特異性條帶則證明被檢測菌株為低分泌蛋白酶A釀酒酵母菌株。
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