[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法

有效

• 申請號: 201410715077.7
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104450611B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;馮德龍;王小燕;馬巖巖
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州圣理華知識產權代理有限公司 44302
• 代理人: 頓海舟;陳業勝

本發明涉及一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，包括以下步驟：提供人類羊膜組織、用PBS緩沖液沖洗然后剪碎、加入質量濃度為0.1～0.3％的胰蛋白酶進行消化、加入I型膠原酶及高糖DMEM基本培養基至I型膠原酶終濃度為0.1～0.2％消化、離心分離，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重懸，過濾后離心分離，棄去上清液，獲得人羊膜間充質干細胞。與現有技術相比，本發明利用少量胰蛋白酶預處理羊膜組織，使羊膜組織疏松，進而利用組織特異性更好的I型膠原酶處理羊膜，大大縮短了消化的時間，簡化了原代分離的步驟，而且能夠獲得較高的干細胞產量，獲得的干細胞活力也相比現有技術大大提高。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，具體涉及一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多功能干細胞，廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養擴增，并能在特定條件下分化為神經細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等。MSCs是多能干細胞，具有“橫向分化”或“跨系分化”的能力，不僅支持造血干細胞的生長，還可以在不同誘導條件下，在體外分化為多種組織細胞。MSCs具有廣闊的臨床應用前景，是細胞替代治療和組織工程的首選種子細胞。

骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是較早被認識的一種間充質干細胞，但由于抽取骨髓會給患者帶來極大的痛苦，而且隨著年齡的增長，細胞數量顯著下降，分化能力逐漸降低，從而較難進行推廣使用。目前已從脂肪、脾臟、臍血、臍帶、胎肝及胎腎等組織器官中分離出間充質干細胞，但均存在一定的局限性，如取材困難、受年齡限制、涉及倫理問題、組織中間充質干細胞含量少等。所以尋求一種來源豐富，干細胞含量高，取材方便，無創性并且不受倫理學限制的MSCs來源已然成為如今的研究熱點。

最近有研究發現，AMSCs具有與BMSCs相似的表型，且具有自我更新和多向分化潛能，且增殖能力比BMSCs更強。AMSCs低表達HLA-ABC，而不表達HLA-DR，從而說明AMSCs具有低免疫原性，用于同種異體、異種異體移植后，均不會發生免疫排斥反應，而且AMSCs無致瘤性，這為各種疾病的細胞替代治療提供了新的選擇。

人羊膜來源于人胎盤組織，無血管、神經及淋巴，具有一定的彈性，厚0.02～0.5mm。在電鏡下，其分為5層：上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層。羊膜屬于孕婦生產后的廢棄物，一個胎盤的羊膜面積大約有600cm²，而且羊膜易于從胎盤剝離，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特點而被認為是目前間充質干細胞的最佳來源。目前，hAMSCs原代分離培養方法可分為組織塊培養法和酶消化培養法兩種，組織塊培養法由于不是每個組織塊都能成功培養出細胞，且容易混入其他雜細胞，同時培養周期較長，不利于快速大量獲取細胞，難以滿足干細胞研究的需求。酶消化培養法是目前羊膜干細胞分離方法的主流，不過鑒于羊膜組織結構致密，消化酶的類型選擇會對干細胞分離后的活性有著至關重要的影響?，F有技術利用II型膠原酶分離的技術有著耗時長，細胞得量低以及活性下降等弱點。

發明內容

發明的目的在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，該方法利用少量胰蛋白酶預處理羊膜組織，使羊膜組織疏松，進而利用組織特異性更好的I型膠原酶處理羊膜，大大縮短了消化的時間，簡化了原代分離的步驟，而且能夠獲得較高的干細胞產量，獲得的干細胞活力也相比現有技術大大提高。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)提供人類羊膜組織；

(2)用PBS緩沖液沖洗，然后將羊膜組織剪碎；

(3)加入質量濃度為0.1～0.3％的胰蛋白酶進行消化；