[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法

有效

• 申請號: 201410715077.7
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN104450611B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;馮德龍;王小燕;馬巖巖
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州圣理華知識產權代理有限公司 44302
• 代理人: 頓海舟;陳業勝

1.一種人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)提供人類羊膜組織；

(2)用PBS緩沖液沖洗，然后將羊膜組織剪碎；

(3)加入質量濃度為0.1～0.3％的胰蛋白酶進行消化；

(4)消化后的羊膜組織用PBS緩沖液沖洗，然后將羊膜組織剪碎；

(5)將羊膜組織剪碎至1mm²后轉移至125mL儲液瓶中，加入20mL質量濃度為0.5％的I型膠原酶及高糖DMEM基礎培養基，至I型膠原酶終濃度為0.075～0.2％進行消化，消化在恒溫搖床中進行，消化溫度為37℃,轉速為250～300r/min,消化至組織塊融化；

(6)用PBS緩沖液稀釋消化后的組織液，離心分離，取沉淀物；

(7)沉淀物用PBS溶液重懸，過濾后離心分離，棄去上清液，獲得人羊膜間充質干細胞；

(8)使用無血清培養基重懸人羊膜間充質干細胞，調整細胞密度為(3～10)×10⁵/mL置于添加了EGF的培養皿中，移入CO₂培養箱中培養48h后換液，去除雜質，每隔2～3d換一次培養基；

其中，所述無血清培養基為UltraCULTURE MEDIUM培養基；步驟(2)將羊膜組織剪碎至6×6cm²分裝于50mL離心管中，步驟(3)胰酶添加量為45mL，并在恒溫搖床中消化，消化時間為30min，消化溫度為37℃，轉速為150～300r/min；步驟(8)采用規格為10cm的培養皿，EGF添加量為100μL，濃度為1μg/mL。

2.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，其特征在于：步驟(6)離心速度為1500～2000r/min，離心時間為5min。

3.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，其特征在于：步驟(7)經100μm過濾篩網過濾，離心速度為1500～2000r/min，離心時間為5min。

4.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞原代分離及培養方法，其特征在于：待原代人羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，用0.25％的EDTA-Trypsin消化，進行傳代培養。