[發明專利]一種多胎羊的檢測方法

在審

• 申請號: 201410710810.6
• 申請日: 2014-11-29
• 公開（公告）號: CN104328214A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 左北瑤
• 申請（專利權）人: 新疆巴音郭楞蒙古自治州畜牧工作站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽天圣知識產權代理有限公司 52107
• 代理人: 杜勝雄

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，具體是一種多胎羊的檢測方法。

背景技術

綿羊育種主要是改善其生長和繁殖性狀。迄今為止已發現了一些控制這些生長和繁殖性狀的基因，比如，BMPR-IB、BMP15和GDF9已被確認為綿羊的高繁殖力主效基因；黑素皮質素受體-4(melanocortin-4receptor，MC4R)是一類G-蛋白偶聯受體，主要在下丘腦表達，在體重、能量平穩和采食量的調控中發揮重要作用；鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是鈣蛋白酶系統的主要成員之一，它是鈣激活蛋白酶的抑制因子，可以通過激活鈣蛋白酶或降低鈣蛋白酶抑制蛋白的活性來提高肌肉的嫩度，改善肉質。

隨著分子遺傳學的發展，利用分子標記輔助選擇育種技術可以快速提高一些單胎品種雙胎率，或者提高其胎產羔數，從而大幅度提高其繁殖力。分子標記輔助選擇是通過分子生物學技術直接分析DNA分子的一些突變位點，可以準確判斷基因型，而且不受時間的限制，可以做到早期選擇。

目前檢測DNA突變位點的方法一般采用限制性片段長度多態性技術和單鏈構象多態性技術，這兩種方法依靠肉眼進行結果的觀察，有時會出現判斷錯誤，從而影響檢測結果的可靠性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種多胎羊的檢測方法，利用連接酶檢測反應技術及生物信息學技術，檢測綿羊繁殖候選基因在綿羊中的多態性，從而判斷出多胎羊。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種多胎羊的檢測方法，具體步驟如下：

(1)DNA的提取：從羊的頸靜脈采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混勻后-20℃凍存后，采用細胞裂解和蛋白去除液從凍存的抗凝全血中得到基因組DNA；

(2)引物和探針的設計：根據基因序列設計引物，同時根據LDR探針設計原則設計探針；

(3)PCR-LDR反應，分為PCR反應和LDR反應；

(4)數據分析和基因分型：取1μL?LDR連接產物與1μL?ABI?GS?500?ROX熒光標記分子量標準和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2min，冰中驟冷，于含有5mol/L尿素的5％聚丙烯酰胺凝膠中電泳2.5h，進行數據收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和校正內在分子量標準；進行數據分析和基因分型。

作為本發明進一步的方案：所述步驟(1)還包括采用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

作為本發明進一步的方案：所述PCR反應包括以下小步驟：

1)準備20uL體系PCR?Master?Mix

在1.5ml離心管中分別加入10×PCR-buffer200ul，100mM?Mg²⁺60ul，20mM/each?dNTP?200ul，5U/ul?Taq酶20ul，4×Q-solution400ul，5pM?primer40ul，最后加入980ul去離子水，充分混勻后離心，再取19ul分裝在200ul的PCR反應管中，最后再加入1ul基因組DNA；

2)將PCR反應管放入PCR儀進行反應，反應程序為：95℃變性15m，35個循環，每個循環有3個溫度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；

3)反應結束后，取2μl反應產物在3.0％瓊脂糖膠，0.5×TBE中電泳，檢測反應是否成功；

4)剩余樣品保存于-20℃。

作為本發明進一步的方案：所述LDR反應包括以下小步驟：

1)準備10ul體系連接反應Mix

在PCR反應產物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應的模板；

2)在1.5ml離心管中分別加入10×buffer100ul，100ul?Probe?Mix，5ul連接酶，695ul去離子水，充分混勻后離心，再取9ul分裝在200ul的PCR反應管中，最后再加入1ulPCR反應產物；

3)將PCR反應管放入PCR儀進行連接反應，反應程序為：95℃變性2m，35個循環，每個循環有2個溫度，94℃30s，50℃2m。

作為本發明進一步的方案：所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、MC4R基因和CAST基因。

作為本發明進一步的方案：所述方法還包括卡方檢驗、遺傳參數和最小二乘方差分析。