[發明專利]一種多胎羊的檢測方法

在審

• 申請號: 201410710810.6
• 申請日: 2014-11-29
• 公開（公告）號: CN104328214A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 左北瑤
• 申請（專利權）人: 新疆巴音郭楞蒙古自治州畜牧工作站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽天圣知識產權代理有限公司 52107
• 代理人: 杜勝雄

1.一種多胎羊的檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）DNA的提?。簭难虻念i靜脈采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混勻后-20℃凍存后，采用細胞裂解和蛋白去除液從凍存的抗凝全血中得到基因組DNA；

（2）引物和探針的設計：根據基因序列設計引物，同時根據LDR探針設計原則設計探針；

（3）PCR-LDR反應，分為PCR反應和LDR反應；

（4）數據分析和基因分型：取1μL?LDR連接產物與1μL?ABI?GS?500?ROX熒光標記分子量標準和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2min，冰中驟冷，于含有5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2.5h，進行數據收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和校正內在分子量標準；進行數據分析和基因分型。

2.根據權利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）還包括采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

3.根據權利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應包括以下小步驟：

1）準備20uL體系PCR?Master?Mix

在1.5ml離心管中分別加入10×PCR-buffer200ul，100mM?Mg²⁺?60ul，20mM/each?dNTP?200ul，5U/ul?Taq酶20ul，4×Q-solution400ul，5pM?primer40ul，最后加入980ul去離子水，充分混勻后離心，再取19ul分裝在200ul的PCR反應管中，最后再加入1ul基因組DNA；

2）將PCR反應管放入PCR儀進行反應，反應程序為：95℃變性15m，35個循環，每個循環有3個溫度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；

3）反應結束后，取2μl反應產物在3.0％瓊脂糖膠，0.5×TBE中電泳，檢測反應是否成功；

4）剩余樣品保存于-20℃。

4.根據權利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述LDR反應包括以下小步驟：

1）準備10ul體系連接反應Mix

在PCR反應產物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應的模板；

2）在1.5ml離心管中分別加入10×buffer100ul，100ul?Probe?Mix，5ul連接酶，695ul去離子水，充分混勻后離心，再取9ul分裝在200ul的PCR反應管中，最后再加入1ulPCR反應產物；

3）將PCR反應管放入PCR儀進行連接反應，反應程序為：95℃變性2m，35個循環，每個循環有2個溫度，94℃30s，50℃2m。

5.根據權利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、MC4R基因和CAST基因。

6.根據權利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述方法還包括卡方檢驗、遺傳參數和最小二乘方差分析。