[發明專利]電化學發光檢測外周血循環腫瘤細胞抗原的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201410710610.0
• 申請日: 2014-12-01
• 公開（公告）號: CN104568923A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 王曉稼;沈曉亮;楊祖立;張劍琦;陳占紅;邵喜英;陳歡
• 申請（專利權）人: 浙江省腫瘤醫院;浙江天科高新技術發展有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種電化學發光檢測外周血循環腫瘤細胞抗原的方法，其特征在于：用富集緩沖液將血液樣本移至離心管中，并定容，混勻；離心，棄上清，裂解紅細胞并重選細胞；加富集緩沖液，重懸細胞；離心，棄上清，加入富集緩沖溶液和EpCAM抗體磁珠，混勻，孵育；將離心管靜置于磁性底座后除去上清液；加入清洗緩沖液，洗滌后得磁性微球體系；之后將Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-腫瘤細胞抗體加到磁性微球體系中，混勻，孵育；將離心管靜置于磁性底座上，除去上清液；加入清洗緩沖液，洗滌；置于電致化學發光檢測儀中，測出腫瘤細胞表面抗原的含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗體磁珠的制備方法如下：利用攪拌器對鏈霉親和素磁珠進行充分混勻，然后吸取100μL的磁珠均勻溶液，相當于1mg?磁珠；加入含有2μg?生物素標記EpCAM抗體的溶液，混勻；在室溫下旋轉搖床孵育；靜置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗緩沖液，洗滌，然后靜置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存緩沖液，混勻，于4℃保存。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗體磁珠的制備方法如下：利用攪拌器對鏈霉親和素磁珠進行充分混勻，然后吸取100μL的磁珠均勻溶液，相當于1mg?磁珠；加入含有2μg?生物素標記二抗的溶液，混勻；在室溫下旋轉搖床孵育；靜置于磁性底座上1min，除去上清液；加入清洗緩沖液，洗滌；再加入EpCAM抗體溶液，混勻；在室溫下旋轉搖床孵育；靜置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗緩沖液，洗滌；然后靜置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存緩沖液，混勻，于4℃保存。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的腫瘤細胞抗體為Her2抗體。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的合成方法如下：首先分別稱取0.2g二氯二聯吡啶釕Ru(bpy)₂Cl₂，0.2gNaHCO₃和0.15g?2,2'-聯吡啶-4,4'二羧酸(dcbpy)置于100mL圓底燒瓶中，加入40mL80%甲醇，混合溶液在硅油浴80℃下加熱回流l0h，所得溶液在冰浴中冷卻2h，邊冷卻邊用1mol/L的H₂SO₄將pH值精確調節到4.4，形成的沉淀用濾紙過濾，再用甲醇洗滌沉淀3次，每次用量2-3mL，過濾后取濾液，向所得濾液中加入6.25mL7.44×10^-4?mol/L的NaPF₆溶液，并在磁力攪拌器上攪拌30min使其混合均勻，然后將上述溶液置于冰箱中4℃下揮發其濾液，10天后將其過濾，用甲醇洗滌沉淀3次,每次用量2-3m，得到的晶體再用甲醇進行重結晶，收集重結晶得到的紫紅色結晶即為Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂；分別稱取0.46g?(2.2mmol)二環乙基碳二亞胺(DCC)和0.24g?(2.1mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解于3mL無水DNF中并進行攪拌，然后放在冰水混合物中冷卻，再稱取0.31g的Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂溶解于2?mL的DNF中，上述兩種溶液在冰浴條件下混勻，置于25℃水浴中磁力攪拌5h，所得沉淀通過吸濾裝置除去，濾液中含有活性的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-腫瘤細胞抗體制備方法如下：向離心管中依次加入50μL?2.0×10^-5mol/腫瘤細胞抗體，50μL的1.93×10^-2mol/L?Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS，10μL的DMF和388μL0.lmol/L的碳酸鹽緩沖液(pH9.2)，室溫攪拌孵育6h，可以得到Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-腫瘤細胞抗體；然后通過超濾離心除去溶液中過量的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS，得到純的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-腫瘤細胞抗體。