[發(fā)明專利]IDH1/2基因突變檢測體系及其試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410710286.2
• 申請日: 2014-11-29
• 公開（公告）號: CN105368924B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙新泰;王明;張長順
• 申請（專利權(quán)）人: 上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 上海海頌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

本發(fā)明公開了一種IDH1/2基因突變檢測體系及其試劑盒，包括引物、探針和擴(kuò)增阻斷引物，引物包括質(zhì)控正向引物、檢測正向引物和通用反向引物；所述檢測正向引物包括針對IDH1基因C394T突變位點(diǎn)的檢測正向引物、針對IDH1基因G395A突變位點(diǎn)的檢測正向引物、針對IDH2基因G419A突變位點(diǎn)的檢測正向引物、針對IDH2基因G515A突變位點(diǎn)的檢測正向引物；探針序列的5’端設(shè)有一種熒光標(biāo)記，所述探針的核苷酸序列的3’端設(shè)有另一種熒光標(biāo)記；擴(kuò)增阻斷引物的核苷酸序列的3’端設(shè)有磷酸化修飾。本發(fā)明的IDH1/2基因突變檢測體系及其試劑盒，可對IDH1基因的C394T/G395A突變位點(diǎn)和IDH2基因的G419A/G515A突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷方便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的引物、探針、檢測體系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一類在三羧酸循環(huán)中起重要作用的酶家族，不僅在能量代謝、氨基酸和維生素合成中扮演重要角色，而且對該酶的活性調(diào)節(jié)將直接影響IDH或IDH底物參與不同的生物途徑、發(fā)揮不同的生物功能。在哺乳動物細(xì)胞中,IDH同工酶有三種形式：依賴NAD的線粒體IDH,依賴NADP的線粒體IDH,依賴NADP的胞質(zhì)IDH。

編碼依賴NADP的人異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因位于染色體2q33.3，其轉(zhuǎn)錄mRNA長2339bp，含有10個外顯子，編碼由414個氨基酸殘基組成的異檸檬酸脫氫酶1，主要定位于細(xì)胞漿和過氧化物酶體。IDH1作用于一個稱為檸檬酸周期的能量生成途徑。細(xì)胞溶質(zhì)的IDH1突變是原發(fā)性人體腦瘤主要亞型的共同特點(diǎn)。研究表明癌癥相關(guān)的IDH1突變使該酶具有新的作用，當(dāng)精氨酸132突變?yōu)榻M氨酸時，活性部位殘基所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化傾向于減少IDH1對異檸檬酸鹽的氧化脫羧作用；催化NADPH依賴性的還原反應(yīng),把α-酮戊二酸還原成2-羥基戊二酸(2HG)。2HG作為異檸檬酸脫氫突變后生成并累及的代謝廢物，一般在人體細(xì)胞中含量很低，如果大量累積，就會導(dǎo)致正常細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。2HG通過對DNA、組蛋白甲基化、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1,HIF1α)和HIF2α的作用改變了基因的轉(zhuǎn)錄；2HG過多累積會直接抑制包括人體內(nèi)“組蛋白去甲基化酶”與DNA去甲基化酶在內(nèi)的多個重要雙加氧酶的活力，雙加氧酶的活力降低，改變細(xì)胞的增殖和生長方式，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。已證實(shí)2HG的過度蓄積將導(dǎo)致患有先天性2HG代謝異常的患者出現(xiàn)惡性腦瘤風(fēng)險(xiǎn)升高。同樣，在人體惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤部位，研究發(fā)現(xiàn)2HG水平顯著升高。

另一方面，Chan等人發(fā)現(xiàn)IDH1突變會釋放他們稱為的“表觀遺傳混亂(epigeneticchaos)”而干擾一種能調(diào)控DNA甲基基團(tuán)積累的酶的作用。這種“甲基化”能開啟和關(guān)閉基因表達(dá)。IDH1突變的腦癌具有改變了的DNA甲基化模式；同時他們還發(fā)現(xiàn)表達(dá)突變IDH1的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育出一個與DNA甲基化相呼應(yīng)的像干細(xì)胞一樣的表型，表明突變IDH1可能防止了分化。復(fù)旦大學(xué)的研究人員曾發(fā)現(xiàn)腫瘤衍生的IDH1突變會破壞酶的親和力，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合能力降低，并且突變的IDH1還能與野生型IDH1競爭底物，突變的IDH1與底物結(jié)合形成二聚體，進(jìn)一阻斷IDH1的活性；據(jù)此提出IDH1具有腫瘤抑制子的作用，一旦IDH1發(fā)生突變失活則導(dǎo)致HIF-1通路發(fā)生改變促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

編碼依賴NADP的線粒體IDH2酶的IDH2基因位于染色體15q26.1。其轉(zhuǎn)錄mRNA長1740bp，編碼由452個氨基酸殘基組成的異檸檬酸脫氫酶2.其與IDH1基因具有較高的同源性，其突變同樣與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。