[發(fā)明專利]一種乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高的重組枯草芽孢桿菌有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410709273.3 | 申請日： | 2014-11-27 |
| 公開（公告）號： | CN104498394B | 公開（公告）日： | 2018-03-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳堅;劉龍;堵國成;李江華;馬文龍;劉延峰;朱妍萩;顧洋 | 申請（專利權(quán)）人： | 江南大學(xué) |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N15/75;C12P19/26;C12R1/125 |
| 代理公司： | 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419 | 代理人： | 張勇 |
| 地址： | 214122 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 乙酰 氨基 葡萄糖 產(chǎn)量 提高 重組 枯草 芽孢 桿菌 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高的重組枯草芽孢桿菌，尤其是一種通過同源重組敲除alsS和alsD提高重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)
乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細菌、酵母、霉菌、植物以及動物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養(yǎng)膳食添加來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級別。因此，運用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。
本發(fā)明通過阻斷乙偶姻的合成以減弱糖酵解途徑，避免了重組B.subtilis中心碳代謝溢流造成的乙偶姻、2,3-丁二醇等副產(chǎn)物大量積累，進而提高氨糖合成代謝通量以進一步提高GlcNAc產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高的重組枯草芽孢桿菌，是以枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS為出發(fā)菌株，同時敲除α-乙酰乳酸合成酶編碼基因(alsS)和α-乙酰乳酸脫羧酶編碼基因(alsD)，并表達了氨基葡萄糖乙酰化酶。
所述枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢桿菌168為基礎(chǔ)，基因型作如下改造：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，并以木糖誘導(dǎo)啟動子PxylA調(diào)控表達glmS基因。
所述枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS的構(gòu)建方法參見：Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improvedN-acetylglucosamine production.Yanfeng Liu,et al.Metabolic Engineering,23(2014)p42-52.
所述α-乙酰乳酸合成酶編碼基因如NCBI-Gene ID:936852所示，α-乙酰乳酸脫羧酶編碼基因如NCBI-Gene ID:936857所示。
所述氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)來源于釀酒酵母。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述重組枯草芽孢桿菌的方法，通過同源重組敲除敲除α-乙酰乳酸合成酶編碼基因(alsS)和α-乙酰乳酸脫羧酶編碼基因(alsD)，阻斷宿主菌由丙酮酸生成乙偶姻和2,3-丁二醇的途徑，在已敲除alsS和alsD的宿主菌內(nèi)，運用表達載體pP43NMK過量表達釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)，通過改造代謝途徑，實現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的提高。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基乙酰葡萄糖的方法，是將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30-37℃、200-220rpm條件下培養(yǎng)44-52h。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于江南大學(xué)，未經(jīng)江南大學(xué)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201410709273.3/2.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
