[發(fā)明專利]黃綠蜜環(huán)菌抗肝癌活性組分的提取方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410707944.2
• 申請日: 2014-11-28
• 公開（公告）號: CN105687253A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張耀洲;馬琳
• 申請（專利權(quán)）人: 天津耀宇生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: A61K36/06
• 分類號: A61K36/06;A61P35/00
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 李迎春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃綠蜜環(huán)菌抗肝癌活性組分的提取方 法，以及該提取得到的活性組分在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

黃綠蜜環(huán)菌，俗稱黃蘑菇，其風(fēng)味獨特，是一種優(yōu)良的野生食用與藥用真菌，也是 一種重要的高原生物資源，在青海祁連被稱為祁連“八寶”之一。野生黃綠蜜環(huán)菌子實 體子肥厚，味道鮮美、滑脆爽口，具有特殊的香味，且營養(yǎng)豐富，含豐富的蛋白質(zhì)、氨 基酸、維生素、礦物質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油和多糖等營養(yǎng)成分，還含有少量有機酸、黃酮、 強心苷、揮發(fā)油、甾體三萜類、苷類、香豆素萜類、鞣質(zhì)、酚類等化合物。特別是硒的 含量很高，具有很強的抗肝癌功能。研究表明黃綠蜜環(huán)菌還具有防治神經(jīng)炎、腳氣病、 促進兒童發(fā)育、抗衰老、抗流感以及抗腫瘤等生物活性。

公開號為101709322B的中國發(fā)明專利“生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法” 公開了一種通過黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸；公開號為101113413B的中國發(fā)明 專利“一種黃綠蜜環(huán)菌纖溶酶及其生產(chǎn)方法”公開了一種利用黃綠蜜環(huán)菌代謝合成纖溶 酶的方法；公開號為100999750B的中國發(fā)明專利“一種微生物細胞生物轉(zhuǎn)化對羥基苯 甲醇合成天麻素的方法”公開了一種利用黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化合成天麻素的方法。上述 中國專利文件中關(guān)于黃綠蜜環(huán)菌子實體的研究，主要集中在生物轉(zhuǎn)化上，并未涉及黃綠 蜜環(huán)菌子實體的化學(xué)成分，對其化學(xué)成分的研究甚少。

李世峰等發(fā)表的“兩種野生食用菌抗氧化及抗腫瘤活性研究”(中國食用菌 [J].2004,24(3):58-63)中公開了一種黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性組分的提取方法：將子實體 粉碎，用80％乙醇加熱回流3h，重復(fù)提取3次，提取液合并濃縮后，依次用石油醚和 乙酸乙酯萃取，剩余部分用三倍體積無水乙醇沉淀，共得到石油醚相、乙酸乙酯相、剩 余醇溶相和水溶性粗多糖四相提取物，分別烘干備用。該方法存在以下缺陷：(1)采 用傳統(tǒng)的溶劑萃取法(液液萃取)進行有效活性組分的提取，批次之間不具有重復(fù)性， 即無法保證第一批萃取得到的物質(zhì)組分與第二批萃取得到的物質(zhì)組分之間的一致性；(2) 采用這種液液萃取的方法，物質(zhì)在不同溶劑中的分配過程需要的時間非常長，而且要多 次萃取(一般三次，每次換新的溶劑)、然后合并，這導(dǎo)致整個提取過程的時間周期長， 試劑耗費量大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃綠蜜環(huán)菌抗肝 癌活性組分的提取方法，該方法對樣品初步處理后，主要采用高效液相色譜進行分離純 化，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡單省時，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種黃綠蜜環(huán)菌抗肝癌活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟：

(1)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，室溫陰干處理后，在40～60℃溫度下烘干脫水， 然后進行超微粉碎處理，獲得超微粉；

(2)將步驟(1)所得的超微粉按1g︰(5～15)mL的料液比加入乙醇，在30～70 ℃溫度下提取1～6h，每0.5h～1h攪拌一次，室溫靜止1～5h后離心，取沉淀重復(fù)1～3次， 合并所得上清液減壓濃縮至膏狀，獲得黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物；

(3)按質(zhì)量體積比(g/mL)加入5～10倍的正己烷-乙醇二元混合溶劑，進行超聲 溶解，溶解后過有機濾膜，得到黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物的樣品溶液；

(4)將步驟(3)獲得的小分子乙醇提取物的樣品溶液在以填料為正相分離材料 Silica的制備色譜上進行分離純化，采用A為正己烷、B為乙醇的二元流動相體系，分 離純化的條件為：0～18min93％A-7％B(即按體積百分比93％A、7％B配比而成，下同 理)等度洗脫、18～28min60％A-40％B等度洗脫、28～45min5％A-95％B等度洗脫，根 據(jù)紫外吸收光譜收集20-26min洗脫液(Fr5峰)、27.25-28.5min洗脫液(Fr7峰)、 38.5-41min洗脫液(Fr13峰)，減壓濃縮并烘干，得到本發(fā)明抗肝癌活性組分。

作為優(yōu)選，所述步驟(1)中超微粉碎在-20～4℃溫度下進行，時間為5～20min。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中乙醇的提取溫度為30～70℃，優(yōu)選為65℃。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中正己烷-乙醇二元混合溶劑的正己烷與乙醇的體積比為 2︰1。