[發明專利]用于輔助鑒定大豆M型細胞質雄性不育恢復基因Rf-m1的分子標記的引物

在審

• 申請號: 201410707704.2
• 申請日: 2014-12-01
• 公開（公告）號: CN104450900A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王大剛;黃志平;張磊;李杰坤;胡國玉
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及大豆分子育種技術領域，尤其涉及一種大豆M型細胞質雄性不育恢復基因(Rf-m1)區段的分子標記，可用于分子標記輔助恢復基因的選擇育種。

背景技術

細胞質雄性不育(cytoplasmic?male?sterility，CMS)，是指植物不能產生花粉或產生的花粉無活力，導致雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一種母性遺傳現象(Schnable等，1998)。王曙明等(2009)認為利用細胞質雄性不育系進行三系配套育種是作物雜種優勢利用的重要途徑，而雜種優勢利用是大幅度提高大豆產量的有效措施之一。大豆細胞質雄性不育最早是由Davis(1985)獲得的質核互作雄性不育的不育系和保持系，但未見進一步的報道。2004年，趙麗梅等研究培育出世界上第一個比對照增產20.8％的三系大豆雜交種“雜交豆1號”，該品種不僅品質優良，抗病性強，而且促使大豆產量大幅度的提高(趙麗梅等，2004)。目前，國內多個研究單位報道育成多個不育系并實現三系配套，使我國的大豆雜種優勢利用研究處于國際前列(張磊等，2007；彭寶等，2008，2010，2013)。

優良恢復系是利用CMS系統配制雜交種的基礎，但育性恢復性易受環境影響，并且需通過測交才能確定。定位恢復基因，利用分子標記對恢復基因進行標記輔助選擇，可提高育種效率。目前，已有研究者利用分子標記對大豆細胞質雄性不育恢復基因進行了定位，這在一定程度上提高了選擇的可靠性(許占友等，1999；趙麗梅等，2007；Yang等，2007；Wang等，2010；李曙光等，2010；Dong等，2012)，但卻并不能滿足國內雜交大豆育種對恢復系輔助選育的需求。

M型大豆細胞質雄性不育系W931A是張磊等(1997)利用栽培大豆品種間雜交、回交育成的不育材料，不育性徹底，并獲農業部植物新品種權保護(品種權號CNA20010017.3)。利用該不育系，先后育成了世界上第一個雜交夏大豆雜優豆1號(張磊等，2007)和雜交大豆雜優豆2號(黃志平等，2013)。育性的遺傳分析表明，大豆M型不育系統為單基因配子體不育，育性恢復受1對顯性基因恢復(張磊等，2007；湯復躍等，2009)。湯復躍等(2009)雖然獲得了與恢復基因連鎖的分子標記，這在一定程度上提高了恢復系選擇的速度，且操作簡單，但是這些標記大都與恢復基因的連鎖距離較遠，選擇的準確性一般較低。基于此，Wang等利用連鎖分析的方法對大豆M型細胞質雄性不育恢復基因進行精細定位，在大豆的16號染色體上發現了與恢復基因(Rf-m1)緊密連鎖的分子標記。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種用于輔助鑒定大豆M型細胞質雄性不育恢復基因Rf-m1的分子標記的引物。

本發明要解決的另外一個技術問題是提供一種上述引物用于制備鑒定大豆恢復性材料分子標記的方法。

本發明要解決的還有一個技術問題是提供一種上述引物在大豆M型細胞質雄性不育恢復基因分子標記輔助轉育中的應用。

對于用于輔助鑒定大豆M型細胞質雄性不育恢復基因Rf-m1的分子標記的引物，本發明采用的技術方案是：引物是具有如SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ?ID?NO：2所示核苷酸序列的下游引物。

對于上述引物用于制備鑒定大豆恢復性材料分子標記的方法本發明采用的技術方案是包括以下步驟：

(1)大豆材料基因組DNA的提取；

(2)對大豆基因組DNA進行PCR擴增；

PCR擴增反應體系為：4μL?Taq×Master?PCR?Mix，2.0μL濃度為1ppmol/L上述的上下游引物，20ng/μL模板DNA3μL，ddH₂01μL；反應總量10μL；PCR反應在PTC-2225熱循環儀上進行，反應程序包括：94℃預變性5min，每個循環95℃變性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，共30個循環，最后72℃延伸10min，12℃保存；

(3)反應產物在質量比8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色并于凝膠成像系統下觀察，記載。

上述引物在大豆M型細胞質雄性不育恢復基因分子標記輔助轉育中的應用。

本發明的有益效果是：

(1)本發明提供的分子標記與現有的大豆M型細胞質雄性不育恢復基因的分子標記相比，它具有與恢復基因Rf-m1連鎖更緊密的分子標記，可減少由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定，而且在操作上高效、快捷。