[發明專利]交聯聚合固載β-葡萄糖苷酶的方法

有效

• 申請號: 201410706930.9
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104480096B
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 張志琪;賀天;張婧
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發明公開了一種交聯聚合固載β?葡萄糖苷酶的方法，以β?葡萄糖苷酶為來源，經硫酸銨沉淀、戊二醛交聯，與氨基功能化的聚甲基丙烯酸環氧丙酯樹脂微球形成酶交聯自聚體，增強了酶的生化性質，并用于水解纖維二糖，大大加快了纖維二糖的水解速率。本發明操作簡單，制備耗時短，對酶的活性影響小，水解纖維二糖快。

技術領域

本發明屬于生物酶的固載技術領域，具體涉及一種以飽和硫酸銨為沉淀劑，戊二醛為交聯劑，采用交聯聚合的方法制備固載β-葡萄糖苷酶。

背景技術

酶作為一種天然的高分子催化劑，因具有極高的專一性、催化反應條件溫和、催化反應速度快、無污染等諸多優點，使其在食品加工、醫藥等產業中有著極為廣闊的應用前景。近年來，酶被人們廣泛應用于食品生產與檢測、生物傳感器、醫藥工程、環保技術、生物技術等領域。但在實際應用中，酶對環境敏感、反應后難以回收等缺點限制了酶制劑產品的開發和應用，在這種情況下，固定化酶技術應運而生。所謂固定化酶是指在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應，反應后的酶可以回收重復使用。與游離酶相比，固定化酶具有的優點有：可以在較長時間內反復利用，反應過程可以嚴格控制，有助于提高酶的穩定性，酶易于與底物和產物分開，增加產物的收率，提高產物的質量，提高酶的使用效率，成本降低等。

目前關于固定化酶的方法主要有以下幾種：(1)包埋法，該方法操作步驟簡單，成本低，污染少，但是此法只適用于小分子底物和產物的酶催化反應，且固載酶易從包埋材料中漏出導致失活；(2)吸附法，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復使用，但酶與載體結合不牢，極易脫落；(3)共價鍵合法，此方法研究較為成熟，其優點是酶與載體間連接牢固，即使用高濃度底物或離子強度的溶液進行反應，也不會導致酶和載體的分離，因此具有良好的穩定性及重復使用性，缺點是反應步驟較為繁瑣，反應條件較為苛刻，常常會引起酶蛋白結構發生改變，導致酶的活性中心受損。

現有的固載技術對于β-葡萄糖苷酶的固載量、耐酸堿性、熱穩定性以及貯存穩定性等性能都有提升，但對纖維二糖的水解速率卻提升不明顯。Wei等通過將β-葡萄糖苷酶固載到功能化的二氧化鈦表面上，提高了其耐酸堿性、熱穩定性以及貯存穩定性，但對纖維二糖的水解速率較低，需要水解6小時才能達到90％的水解率(Immobilization ofβ-glucosidase on mercaptopropyl-functionalized mesoporous titanium dioxide，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013，97，303-310)。Verma等將β-葡萄糖苷酶固載到磁性納米顆粒上，70℃下4小時內酶活性仍然保留67％，但其對纖維二糖的水解速率也較低，需要水解5小時才能達到90％左右的水解率(Immobilization of β-glucosidase on a magnetic nanoparticle improves thermostability:Applicationin cellobiose hydrolysis，Bioresource Technology，2013，135，2-6)。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于克服現有固定化酶技術中關于酶失活所存在的不足，提供一種以硫酸銨為沉淀劑，戊二醛為交聯劑，通過交聯固載β-葡萄糖苷酶的方法，該方法操作簡單、耗時短，固載效率高，酶活性損失小，且水解纖維二糖的速率高。

解決上述技術問題所采用的技術方案是：將β-葡萄糖苷酶完全溶解于20mmol/LpH值為4.8的醋酸鈉緩沖液中，加入氨基功能化的聚甲基丙烯酸環氧丙酯樹脂微球，混合均勻，加入沉淀劑，常溫震蕩20～40分鐘，離心洗滌，所得沉淀加入20mmol/L pH值為4.8的醋酸鈉緩沖液中，再加入質量分數為50％戊二醛水溶液，所得混合液中戊二醛的質量分數為0.2％～1％，室溫震蕩1～5小時，離心洗滌，得到固載β-葡萄糖苷酶。