[發明專利]黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農桿菌菌株及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410706857.5
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104498521A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 燕飛;鄭紅英;肖彩利;韓科雷;魯宇文;林林;陳劍平
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體的說，本發明涉及一種RNA植物病毒-煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus,?CGMMV）侵染性克隆載體制備及攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株的致病性分析。

背景技術

黃瓜綠斑駁花葉病毒屬于蕪菁花葉病毒科(Tymoviridae)煙草花葉病毒屬(genus?Tobamovirus)成員，其病毒粒子形態為桿狀，病毒基因組約為6.4kb，包括5’-及3’-端非編碼區和4個開放性的閱讀框，分別編碼129kDa和186kDa復制相關蛋白、29kDa的移動蛋白及17.4kDa的外殼蛋白。該病毒嚴重威脅著瓠瓜（Lagenaria?siceraria）、西瓜(Citrullus?lanatus)、甜瓜（Cucumis?melo）、黃瓜（Cucumis?sativus?Linn.）等葫蘆科作物的生產，是世界上許多國家和地區葫蘆科植物上的重要檢疫性病毒。其傳播主要是通過帶毒種子遠距離傳播，介體、汁液和被病殘體污染的土壤等也能傳毒。目前在我國廣西、遼寧、北京、河北、甘肅、山東、湖南、上海等多個地區均檢測到CGMMV的發生，并呈擴展蔓延趨勢，對葫蘆科蔬菜和瓜果的生產造成重要經濟損失。

植物病毒侵染性克隆的獲得是研究病毒基因功能的前提，運用構建的侵染性克隆很容易通過基因交換、突變、缺失、插入、重組等實驗來分析病毒基因的功能，鑒定病毒基因在侵染植株中產生的效應。1983年首次在雀麥花葉病毒（Brome?mosaic?virus,?BMV）中獲得第一例有侵染活性的植物RNA病毒cDNA克隆。隨后該技術迅速發展，目前主要構建策略有攜帶T7、SP6或T3等原核啟動子控制的侵染性克隆和由花椰菜花葉病毒（Cauliflower?mosaic?virus,?CaMV）35S啟動子控制的侵染性克隆兩種。本發明在獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒基因組全序列的基礎上，構建了該病毒的侵染性克隆。將包含35S啟動子的黃瓜綠斑駁花葉病毒cDNA序列構建入雙元載體pCB301-CH中，通過農桿菌介導轉化后在寄主體內轉錄、復制、侵染，以用于病毒的功能基因組研究。

發明內容

為了解決上述的技術問題，本發明的第一個目的是提供黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus,?CGMMV）的侵染性克隆載體及其制備方法，本發明的第二個目的是提供攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用。

為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案：

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus,?CGMMV）的侵染性克隆載體，該侵染性克隆載體由黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301-CH制備得到，所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列如Seq?ID?No:12所示。

上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，該方法包括以下的步驟：

1）獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列；

2）設計引物pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV?(-)，CGMMV3145(+)和引物CGMMV3145(-)；分別以引物對pCass-CH-CGMMV(+)/CGMMV3145(-)和引物對CGMMV3145(+)/?pCass-CH-CGMMV?(-)分兩段擴增CGMMV全序列；所述的引物pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV?(-)，CGMMV3145(+)和引物CGMMV3145(-)的基因序列分別為Seq?ID?No:10，Seq?ID?No:11，Seq?ID?No:8，Seq?ID?No:9；

3）將純化的擴增目的片段與經Stu?I和Sma?I?雙酶切的pCB301-CH載體進行重組反應，然后將連接產物轉入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出具有正確CGMMV基因組全序列的克隆；

4）提取包含CGMMV全長質粒的克隆，獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體pCB301-CGMMV。

作為優選，所述的步驟1）中黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列獲得包括以下的步驟：

1.1）植物總RNA的提取：采用Trizol法提取病葉的總RNA；