[發明專利]黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農桿菌菌株及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410706857.5
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104498521A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 燕飛;鄭紅英;肖彩利;韓科雷;魯宇文;林林;陳劍平
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司33214
• 代理人: 王從友

1.黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus,?CGMMV）的侵染性克隆載體，其特征在于：該侵染性克隆載體由黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301-CH制備得到，所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列如Seq?ID?No:12所示。

2.攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農桿菌菌株，其特征在于：該農桿菌菌株由權利要求1所述的導入到農桿菌菌株EHA105獲得。

3.根據權利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列；

2）設計引物pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV?(-)，CGMMV3145(+)和引物CGMMV3145(-)；分別以引物對pCass-CH-CGMMV(+)/CGMMV3145(-)和引物對CGMMV3145(+)/?pCass-CH-CGMMV?(-)分兩段擴增CGMMV全序列；所述的引物pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV?(-)，CGMMV3145(+)和引物CGMMV3145(-)的基因序列分別為Seq?ID?No:10，Seq?ID?No:11，Seq?ID?No:8，Seq?ID?No:9；

3）將純化的擴增目的片段與經Stu?I和Sma?I?雙酶切的pCB301-CH載體進行重組反應，然后將連接產物轉入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出具有正確CGMMV基因組全序列的克隆；

4）提取包含CGMMV全長質粒的克隆，獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體pCB301-CGMMV。

4.根據權利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征在于：步驟1）中黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列獲得包括以下的步驟：

1.1）植物總RNA的提取：采用Trizol法提取病葉的總RNA；

1.2）CGMMV?5’-末端和3’-末端序列的擴增：根據GenBank上發表的CGMMV?基因組全序列，GenBank登錄號NC_001801，設計引物CGMMV?682(-)、CGMMV?1218(-)和CGMMV?CP(+)，引物分別為Seq?ID?No:1、Seq?ID?No:2和Seq?ID?No:3，以3AP/CGMMV?CP(+)為引物進行3’-RACE，獲得完整3’-末端序列；5’-末端序列的獲得首先以5AP/CGMMV?1218(-)進行第一輪擴增，然后以該PCR擴增產物為模板，以5AP/CGMMV?682(-)為引物做巢式PCR進行第二輪擴增，獲得完整5’-末端序列；

1.3）經5’-RACE和3’-RACE確定了CGMMV分離物的5’-末端和3’-末端的序列后，設計引物CGMMVCOM(+)、CGMMV2251(+)、CGMMV3526(-)和CGMMV?COM(-)，序列分別為Seq?ID?No:4、Seq?ID?No:6、Seq?ID?No:5和Seq?ID?No:7；以引物對CGMMVCOM(+)/CGMMV3526(-)和CGMMV2251(+)/CGMMV?COM(-)分兩段擴增CGMMV序列；擴增的PCR產物純化后經測序拼接獲得CGMMV的全序列。

5.根據權利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征在于：步驟1.3）PCR?擴增體系為：9μL?DEPC?水、25μL?2×?PCR?Buffer?for?KOD?FX?Neo、10μL?2?mM?dNTPs、上下游引物(10μM)各1.5μL、2μL?cDNA模板、1μL?KOD-FX-NEO聚合酶，總反應體系為50μL；各片段的反應條件為:?94?℃?2min;?94?℃?15?s,?60℃?30?s,?68?℃?3.5min,?35個循環;?68?℃?10min。