[發(fā)明專利]基于硼酸熒光探針的分子印跡微球檢測(cè)糖蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410705830.4
• 申請(qǐng)日: 2014-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104483295A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張靜;倪艷麗;魏靜茹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于糖蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于硼酸熒光探針的分子印跡聚合物微球?qū)μ堑鞍椎臋z測(cè)方法。

背景技術(shù)

糖蛋白是一類重要的翻譯后修飾蛋白，在分子識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和免疫響應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用。人體免疫系統(tǒng)中幾乎所有參與先天免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵分子都是糖基化蛋白。蛋白質(zhì)糖基化的異常是一些腫瘤性疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程的元兇，當(dāng)腫瘤性疾病發(fā)生時(shí)，細(xì)胞表面的糖蛋白過(guò)量表達(dá)。而一些糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)，已經(jīng)作為臨床上用來(lái)檢測(cè)癌癥的標(biāo)記物。因此，研究糖蛋白具有重要的生理學(xué)意義和臨床價(jià)值，對(duì)了解生命過(guò)程具有至關(guān)重要的作用。然而在糖蛋白組學(xué)研究中，所面臨的樣品都是成分非常復(fù)雜的生物樣品體系，如血液、唾液、尿樣、組織細(xì)胞等，而大部分的糖蛋白的表達(dá)豐度都比較低，往往伴隨著許多高豐度的非糖蛋白。為了研究其中的糖蛋白，需要首先對(duì)這些糖蛋白進(jìn)行富集分離。另外，傳統(tǒng)的質(zhì)譜、色譜和電泳等檢測(cè)方法在檢測(cè)之前需對(duì)生物樣品進(jìn)行處理，而該過(guò)程極其容易破壞蛋白等生物分子并且耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，因此，需發(fā)展一種非破壞性、高靈敏度且快速的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)糖蛋白檢測(cè)所存在的不足，提供一種基于硼酸熒光探針，以指定糖蛋白為模板的分子印跡微球?qū)μ堑鞍椎臒晒鈾z測(cè)方法。

解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合氨基

將單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球在弱酸性條件下水解，得到表面為羥基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，將此微球分散于無(wú)水乙醇中，加入氨水與3-氨丙基三乙氧基硅烷的體積比為1:10～20的混合液，表面為羥基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與3-氨丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量-體積比為1g:20～40mL，超聲分散均勻，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，得到表面鍵合氨基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。

2、單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合硼酸熒光探針

將步驟1得到的表面鍵合氨基的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球分散于無(wú)水乙醇中，依次加入2-(4-二羥基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，表面鍵合氨基的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與2-(4-二羥基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為1:0.8～1.2:0.8～1.2:0.4～0.6，超聲分散均勻，40℃攪拌5～10小時(shí)，得到表面鍵合硼酸熒光探針的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。

3、制備具有熒光特性的指定糖蛋白分子印跡微球

將步驟2得到的表面鍵合硼酸熒光探針的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球和指定糖蛋白加入pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液中，混合均勻，密封，室溫孵育3小時(shí)，所得產(chǎn)物與過(guò)硫酸銨、苯胺在室溫條件下攪拌1～4小時(shí)，其中表面鍵合硼酸熒光探針的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球和指定糖蛋白、過(guò)硫酸銨、苯胺的質(zhì)量比為1:0.005～0.015:0.5～2:1～4，得到具有熒光特性的指定糖蛋白分子印跡微球。

4、熒光法檢測(cè)待測(cè)樣品

將步驟3得到的具有熒光特性的指定糖蛋白分子印跡微球分散于pH值為5.5～9.5的磷酸鹽緩沖液中，配制成0.1mg/mL的指定糖蛋白分子印跡微球分散液，向該分散液中加入指定糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，用熒光光譜儀測(cè)量不同濃度下指定糖蛋白對(duì)應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度隨指定糖蛋白濃度的對(duì)數(shù)值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照上述方法用熒光光譜儀測(cè)量待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可確定待測(cè)樣品中指定糖蛋白的濃度。

上述的步驟3中，優(yōu)選表面鍵合硼酸熒光探針的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球和指定糖蛋白、過(guò)硫酸銨、苯胺的質(zhì)量比為1:0.01:1:1.5。

上述的步驟4中，所述的磷酸鹽緩沖液的pH值最佳為7.5。

上述的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球根據(jù)公開(kāi)號(hào)為CN102382273A、發(fā)明名稱為“17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)的方法制備得到；2-(4-二羥基硼)苯基-4-羧基喹啉由百靈威試劑公司(北京)提供，CAS：373384-17-9。