[發明專利]一種快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法

在審

• 申請號: 201410705508.1
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN104531840A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 田楨干;張子龍;李美;王雪嵋;李深偉;曹敏;湯林華
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法。

背景技術

瘧疾是最嚴重的全球性公共健康問題之一，世界上超過一半的人口生活在瘧疾流行區。近年來我國輸入性瘧疾呈逐年上升趨勢，2011年全國27個省(市、區)報告病例數4479例，輸入病例占66.4％，死亡病例33例。湖南省報告148例，主要為惡性瘧原蟲(Plasmodium?falciparum,P.f)和間日瘧原蟲(Plasmodium?vivax,P.v)感染。目前我國仍采用顯微鏡檢法作為診斷瘧疾的“金標準”，顯微鏡檢法受鏡檢人員的主觀判斷及責任心影響，極容易漏診，延誤治療。為提升對瘧疾病例的實驗室復核和確診能力，近年來以PCR為基礎的分子生物學診斷技術發展迅速。污染風險低、靈敏度及特異性高的Real-time?PCR需要昂貴的儀器及試劑，難以在基層疾控部門推廣。

以PCR技術為代表的分子生物學手段是現在廣泛應用于瘧原蟲快速檢測的技術。而由PCR技術發展起來的實時熒光PCR技術以及基因芯片技術等是目前在瘧原蟲檢測中使用最廣泛的分子生物學方法。實時熒光PCR技術是一種新的PCR方法，是在常規PCR反應的基礎上增加了能與擴增模板特異性結合的探針，與傳統PCR相比，該方法無需對PCR產物進行再處理，完全是在封閉狀態下完成檢測的全過程，具有實時、準確、快速等特點，但是由于對設備要求較高，對工作人員的操作技術難度大，所以不適合快速，準確的檢測。

基因芯片是20世紀90年代發展起來的全新的微量分析技術，它采用微加工和微電子技術將大量的人工設計好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上而得到的一種信息檢測芯片。基因芯片可以同時固定大量的探針分子，理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學指標，這為平行檢測多個菌種或同菌種內多個菌株提供了一條便捷的途徑；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發展前景。

基因芯片技術利用待檢測樣品的基因組序列設計針對各種微生物的特異探針，將該探針(寡核苷酸)點樣于芯片表面，同時在探針兩側設計PCR引物，在引物合成過程中對其5’端進行熒光標記或在PCR過程中加入熒光標記的dNTP，這樣利用PCR擴增的方法即可得到標記有熒光染料的待檢測靶標，然后用含有待檢測樣品特異探針的微陣列芯片與標記的靶標雜交，熒光標記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發生雜交反應，使得芯片上的點呈現出熒光信號，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定瘧原蟲。

當前用于瘧原蟲檢測的基因芯片檢測已經有些應用于研究，但是這些基因芯片的探針點樣多采用手工模式，操作復雜，并且增加了很多假陽性的機會。

本發明整合了聚合酶鏈式反應(PCR)和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應室在同一張芯片上。PCR反應結束后可以直接加入雜交液進行雜交，操作簡單，節省時間，另外靈敏度可以達到幾十個Copy的DNA分子。

本發明的檢測方法可運用于惡性瘧原蟲快速靈敏的檢測，作為血清學試驗及鏡檢法的可靠補充，提高檢測的準確性和時效性，可大大地降低檢測的周期。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，本發明能對惡性瘧原蟲基因進行快速靈敏的檢測，通過本發明可大幅度提高進出口口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止疫情的發生和國外瘧疾的傳入。

本發明針對惡性瘧原蟲特有基因，設計引物，在引物擴增區內設計能夠區別其他瘧原蟲及親緣關系較近的物種的特異性探針，通過探針特異性驗證、探針靈敏度實驗、方法特異性實驗等證明該方法可以特異檢測惡性瘧原蟲，與常規PCR方法比較，檢測靈敏度明顯高于常規方法多重PCR擴增產物的檢測最低檢出限，不僅可以滿足日常疫情安全檢測的要求，甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。

本發明所提供的快速、靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，包括如下步驟：

(1)血液樣本DNA液提取；

(2)PCR擴增：

a.PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液,待測基因特異性正、反向引物，PCR?Grade?H₂O,PCR?Control,DNA提取液；