[發明專利]一種快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法

在審

• 申請號: 201410705508.1
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN104531840A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 田楨干;張子龍;李美;王雪嵋;李深偉;曹敏;湯林華
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)血液樣本進行DNA液提取；

(2)PCR擴增：

a.PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液,待測樣本基因特異性正、反向引物，PCR?Grade?H₂O,PCR?Control,DNA提取液；

b.將PCR反應液加入已含有待測基因特異性探針的芯片反應室內內，將芯片放入機器進行擴增反應；特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他物種；特異性探針點入芯片上；

(3)雜交：PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內雜交反應；

(4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；

(5)結果判讀；

所述的待測基因為惡性瘧原蟲特有基因，分別是mdr基因、crt基因和18SrRNA基因。

2.根據權利要求1所述的快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：所述的特異性引物和探針分別為：

mdr基因

Pf1-F:GTGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA(SEQ?ID?NO?1)

Pf1-R:CGTACCAATTCCTGAACTCACTTGTTC(SEQ?ID?NO?2)

Probe:GAACAAAAAGAGTACCGCTGAA(SEQ?ID?NO?3)

crt基因

Pf2-F:GGTGGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG(SEQ?ID?NO?4)

Pf2-R:CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC(SEQ?ID?NO?5)

Probe：GTATTATTTATTTAAGTGTATGTGT(SEQ?ID?NO?6)?

18SrRNA基因

Lm2-F：ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTAC(SEQ?ID?NO?7)?

Lm2-R：GCTGTAGTATTCAAACACAATGAAC(SEQ?ID?NO?8)?

Probe：CATAACAGACGGGTAGTCAT(SEQ?ID?NO?9)?。

3.根據權利要求1所述的快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(1)中所述的DNA提取可使用血液樣本基因組DNA提取試劑盒提取惡性瘧原蟲DNA；取50ul全血,按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA。

4.根據權利要求1所述的快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(2)中所述的PCR反應體系為：2X?Mater?mix?12.5ul,PrimerD?2.5ul，PCR?Grade?H₂O?4ul,PCR?Control?1ul,Sample?5ul。

5.根據權利要求1所述的快快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(2)中所述的PCR擴增的反應條件是：95℃預變性15min；95℃變性15s，60℃退火40s，72℃延伸30s，45個循環，72℃延伸1min。

6.根據權利要求1所述的快快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(3)中所述的雜交反應條件是：注入的雜交液為14.5ul，反應時間為30min。

7.根據權利要求1所述的快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(2)所述的PCR擴增與步驟(3)所述的雜交在芯片儀上完成。

8.根據權利要求1所述的快快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟(4)中所述的清洗條件是：3000rpm，2min。

9.根據權利要求1所述的快速靈敏的惡性瘧原蟲檢測方法，其特征在于：芯片系統直接檢測血液中提取的DNA，檢測的靈敏限為135copy?DNA分子。