[發明專利]一種用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法

在審

• 申請號: 201410704376.0
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104450899A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 呂家燕;代建麗
• 申請（專利權）人: 武昌理工學院;武漢華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 武漢楚天專利事務所 42113
• 代理人: 孔敏

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法。

背景技術

肺癌是目前世界上最常見、致死率最高的人類惡性腫瘤之一，且發病率在世界范圍內呈上升趨勢。造成肺癌患者高死亡率的原因之一是早期診斷技術的缺乏。科學研究顯示，很多肺癌患者出現臨床癥狀就診時已處于中晚期，其5年生存率不到15％；而肺癌的早期特別是I期的確診將顯著提高患者5年生存率至80％。

肺癌的發生發展與一系列基因包括EGFR、KRAS、ALK等的突變相關，近年來發現RBM5(RNA-binding?motif?protein?5)在肺癌發生發展中具有重要的作用。RBM5于1996年被克隆出來，曾被命名為LUCA-15、RBM5、H37等，是RNA結合基序蛋白家族成員，位于3號染色體短臂2區1帶3亞帶(3p21.3)，在假定的人類肺癌的腫瘤抑制基因區域中。研究發現，3p21.3區域基因的雜合性缺失是肺癌前病變最常見的染色體改變，在人肺癌組織中RBM5存在缺失現象，65％的肺鱗癌患者及85％的肺腺癌患者的RBM5表達水平明顯低于非腫瘤組織。體外細胞實驗及動物實驗表明，RBM5具有抑制肺癌細胞生長和轉移的功能。

基因變異是腫瘤發生的早期事件，對癌癥發生發展中特異基因的監測是篩查早期癌癥的有效手段。熒光原位雜交(Fluorescence?in?situ?hybridization,FISH)以其高靈敏度和特異性成為目前臨床上檢測基因突變的重要技術。目前，ALK基因重排檢測已經用于肺癌的臨床診斷中，雅培Vysis?ALK?Break?Apart?FISH探針試劑盒是肺癌FISH檢測最常用的試劑盒。由于肺癌發生發展中存在眾多基因的作用，多基因檢測的準確率顯著高于單基因檢測，RBM5等新探針的開發將開拓肺癌檢測的途徑，多探針聯用會顯著提高診斷的準確性。RBM5的缺失檢測能在較早階段預示人罹患肺癌的風險。

發明內容

本發明提供一種用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，通過制備的探針檢測RBM5的缺失診斷患者是否罹患肺癌，具有檢測靈敏度高、特異性好的特點，可提高肺癌診斷的準確率。

為實現以上目的，本發明采用以下技術方案：

一種用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、克隆的篩選：通過NCBI?Mapview數據庫檢索所有含有RBM5基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇出最優的克隆；按照篩選出的最優克隆編號購買克隆Life?Technology?RPCI11.C；

步驟二、克隆的培養：

用牙簽挑取克隆RPCI11.C，在含25μg/ml氯霉素的LB固體培養基上劃線，將劃線后的LB固體培養基37℃靜止培養16-24h獲得RPCI11.C單菌落；挑取RPCI11.C單菌落轉入5ml含25μg/ml氯霉素的LB液體培養基中，37℃220rpm/min培養8-12h；取0.5-1ml上述培養液轉入100ml含25μg/ml氯霉素的LB液體培養基中，37℃220rpm/min培養16-24h得到克隆培養液；

步驟三、RBM5基因的提取：

收集上述步驟二得到的克隆培養液，3000rpm/min離心10min；取沉淀，應用質粒DNA提取試劑盒提取RBM5基因；使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RBM5基因的濃度和純度；

步驟四、RBM5基因的鑒定：

針對RBM5基因使用上游引物和下游引物進行PCR擴增，并通過1％糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，以完成RBM5基因的鑒定；

步驟五、RBM5探針的制備：

應用缺口平移法對RBM5基因進行熒光標記，對標記物進行乙醇沉淀獲得RBM5探針，避光、-20℃儲存；

步驟六、RBM5探針的驗證

使用人肺癌組織檢測樣本進行探針驗證。

如上所述的用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，步驟一中所述含有RBM5基因的最優克隆，編號為RP11-493K19。

如上所述的用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，步驟四中RBM5PCR擴增的上游引物為：AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA，下游引物為：GCACCCTACACTTTATCACAGCA。

如上所述的用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，步驟六RBM5探針的驗證具體包括如下步驟：