[發明專利]一種用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法

在審

• 申請號: 201410704376.0
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104450899A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 呂家燕;代建麗
• 申請（專利權）人: 武昌理工學院;武漢華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 武漢楚天專利事務所 42113
• 代理人: 孔敏

1.一種用于肺癌檢測的RBM5?FISH探針的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟一、克隆的篩選：

通過NCBI?Mapview數據庫檢索所有含有RBM5基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇出最優的克?。话凑蘸Y選出的最優克隆編號購買克隆Life?Technology?RPCI11.C；

步驟二、克隆的培養：

用牙簽挑取克隆RPCI11.C，在含25μg/ml氯霉素的LB固體培養基上劃線，將劃線后的LB固體培養基37℃靜止培養16-24h獲得RPCI11.C單菌落；挑取RPCI11.C單菌落轉入5ml含25μg/ml氯霉素的LB液體培養基中，37℃220rpm/min培養8-12h；取0.5-1ml上述培養液轉入100ml含25μg/ml氯霉素的LB液體培養基中，37℃220rpm/min培養16-24h得到克隆培養液；

步驟三、RBM5基因的提取：

收集步驟二得到的克隆培養液，3000rpm/min離心10min；取沉淀，應用質粒DNA提取試劑盒提取RBM5基因；使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RBM5基因的濃度和純度；

步驟四、RBM5基因的鑒定：

針對RBM5基因使用上游引物和下游引物進行PCR擴增，并通過1％糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，以完成RBM5基因的鑒定；

步驟五、RBM5探針的制備：

應用缺口平移法對RBM5基因進行熒光標記，對標記物進行乙醇沉淀獲得RBM5探針，避光、-20℃儲存；

步驟六、RBM5探針的驗證：

使用人肺癌組織檢測樣本進行探針驗證。

2.如權利要求1所述的用于肺癌檢測的RBM5FISH探針的制備方法，其特征在于：步驟一中所述含有RBM5基因的最優克隆，編號為RP11-493K19。

3.如權利要求1所述的用于肺癌檢測的RBM5?FISH探針的制備方法，其特征在于：步驟四中RBM5?PCR擴增的上游引物為：AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA，下游引物為：GCACCCTACACTTTATCACAGCA。

4.如權利要求1所述的用于肺癌檢測的RBM5?FISH探針的制備方法，其特征在于：步驟六RBM5探針的驗證具體包括如下步驟：

(1)將待檢測組織固定在玻片上，對玻片上的待測組織進行預處理；(2)將RBM5探針與玻片上的待測組織進行核苷酸序列的變性雜交；(3)雜交后，對玻片進行洗滌；(4)使用復染液對玻片上的雜交區域進行復染；(5)使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區域。

5.如權利要求4所述的用于肺癌檢測的RBM5?FISH探針的制備方法，其特征在于：步驟(1)所述待檢測組織的預處理為：

(a)石蠟切片80℃溶蠟30min，

(b)Histo-ClearⅡ脫蠟15分鐘，

(c)無水乙醇浸泡10分鐘，

(d)流水沖洗10分鐘，

(e)蛋白酶K?8ug/ml消化1h?40min，

(f)流水沖洗30分鐘。

6.如權利要求4或5所述的用于肺癌檢測的RBM5?FISH探針的制備方法，其特征在于：步驟(2)將所述RBM5探針與待測組織的核苷酸序列變性雜交為：

(a)將經過步驟(1)預處理的石蠟切片98℃水浴浸泡45分鐘，

(b)蒸餾水浸泡5分鐘，

(c)用吸水紙吸干石蠟切片上的水分，

(d)用7μl雜交緩沖液溶解CEP-3探針和RBM5探針，補加水至10μl，

(e)將溶解好的10μl?CEP-3探針和RBM5探針混合液加到切片上的樣本區域上，

(f)用封片膠封片，

(g)封片后的切片75℃靜止7分鐘，

(h)轉入含有37℃熱水的雜交濕盒中，37℃雜交16-24h。