[發明專利]改進的磷脂酶及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410695939.4
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN105695430B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 王明啟;于鈺;許駿
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C07K14/415;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C11B3/00
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本申請描述了改進的磷脂酶，其是融合蛋白，包含磷脂酶部分和蛋白的疏水結構域部分。本申請還描述了改進的磷脂酶的制備方法和用途以及相關的核酸、載體和細胞等。

發明領域

本申請大體上涉及磷脂酶及其工業應用。具體而言，本申請涉及利用分子生物學手段對磷脂酶進行改造，改造后的磷脂酶可應用于，例如，油脂精煉的脫膠工藝中。

發明背景

植物油中存在的磷脂為油脂精煉帶來了一定的技術問題。脫膠是植物油精煉中重要的一步，是指去除溶解在油脂中的各種磷脂類物質的過程。一般而言，脫膠方式可分為三種，包括化學脫膠(例如水化脫膠、酸法脫膠等)、物理脫膠(例如，膜過濾脫膠)和生物學脫膠(例如，酶法)。隨著生物技術的發展，植物油的脫膠過程已經越來越多地采用酶法進行。酶法脫膠是利用磷脂酶水解磷脂的脂肪酸鏈而生成水化性溶血磷脂，再通過水化方法除去。同傳統的脫膠方法相比，酶法脫膠反應條件溫和，可大大節約化學物質的消耗，幾乎不產生廢水，在環保、經濟、質量等方面具有潛在的優勢[1]。

磷脂酶脫膠的效率受多種因素的影響。例如，磷脂酶反應發生在油水界面上，因此增加酶與底物之間的油水界面面積，能夠使磷脂酶高效地發揮作用。目前，本領域中通常的做法是在反應過程中采用強剪切力攪拌等方式使磷脂酶保留在油水界面上。

因此，本領中仍亟需提高磷脂酶活性和反應效率的新方法。

發明概述

第一方面，本申請提供了融合蛋白，其包含磷脂酶部分和蛋白的疏水結構域部分。

在一些實施方案中，磷脂酶為磷脂酶C。

在一些實施方案中，磷脂酶為CLOPLC8(GenBank:D49969.1)。

在一些實施方案中，磷脂酶部分的序列如SEQ ID NO:1所示，或者為保留磷脂酶活性的SEQ ID NO:1的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。

在一些實施方案中，蛋白為油體蛋白。

在一些實施方案中，油體蛋白選自來自大豆、花生、芝麻、芥菜、油菜、向日葵、玉米和棉花的油體蛋白。

在一些實施方案中，油體蛋白為大豆油體蛋白。

在一些實施方案中，油體蛋白的疏水結構域部分為包含有脯氨酸結的疏水結構域部分，優選的，所述疏水結構域部分的序列如SEQ ID NO:5所示，或者為保留了疏水性的SEQID NO:5的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。

在一些實施方案中，SEQ ID NO:5的同源物、變體或片段為保留了脯氨酸結的SEQID NO:5的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。

在一些實施方案中，蛋白的疏水結構域部分是蛋白的跨膜結構域部分。

第二方面，本申請提供了核酸分子，其能夠編碼第一方面所述的融合蛋白。

在一些實施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6所示的多核苷酸。

第三方面，本申請提供了表達載體，其包含第二方面所述的核酸分子。

本申請還提供了表達載體，其包含磷脂酶的編碼核酸和蛋白的疏水結構域的編碼核酸。

在一些實施方案中，表達載體包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6所示的多核苷酸。

第四方面，本申請提供了包含第一方面所述的融合蛋白、或第二方面所述的核酸分子、或第三方面所述的表達載體的宿主細胞。

第五方面，本申請提供了第二方面所述的核酸分子，或第三方面所述的表達載體、或第四方面所述的宿主細胞在制備磷脂酶中的用途。