[發明專利]百合病毒基因芯片、制備方法及利用該基因芯片檢測百合病毒的方法

無效

• 申請號: 201410688135.1
• 申請日: 2014-11-25
• 公開（公告）號: CN104451893A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王進忠;賈慧;董金臯;郝少東;王升啟;張志勇;尚巧霞;楊寶東
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

1.一種百合病毒基因芯片，包括固相載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述探針是選自百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒或百合斑駁病毒中的一種或多種病毒基因對應的核苷酸片段。

2.如權利要求1所述的基因芯片，其特征是所述固相載體是經過醛基化處理的玻片。

3.如權利要求1或2所述的基因芯片，其特征是相鄰探針之間的間距為0.4-0.5mm。

4.如權利要求1或2所述的基因芯片，其特征是所述百合無癥病毒對應的核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所述的堿基序列；所述黃瓜花葉病毒對應的核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4所述的堿基序列；所述百合斑駁病毒對應的核苷酸片段具有如SEQ?ID?NO：5或SEQ?ID?NO：6所述的堿基序列。

5.一種如權利要求1所述的百合病毒基因芯片的制備方法，包括如下順序進行的步驟：

1)設計探針

根據所述的植物百合的3中病毒中的基因序列與NCBI數據庫中的序列比對，選擇所述百合無癥病毒對應的核苷酸序列片段SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2作為探針；選擇所述黃瓜花葉病毒對應的核苷酸序列片段SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4作為探針；選擇所述百合斑駁病毒對應的核苷酸序列片段SEQ?ID?NO：5或SEQ?ID?NO：6作為探針；

2)化學合成原探針

首先，采用化學法分別合成步驟1)設計的百合病毒探針；接著用濃氨水在55℃條件下，進行脫保護/切割處理15h；然后采用OPC柱進行純化，制得化學合成原探針；

3)原探針修飾與加臂

在原探針的3’端以氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂相連，制得氨基修飾與加臂探針；

4)探針固定

首先，將修飾與加臂探針稀釋成50μmol/L的探針溶液；接著將探針溶液按順序點樣于固定載體表面，修飾與加臂的探針的3’端修飾基團氨基與固相載體表面的修飾基團羧基或活潑酯基團進行反應形成酰胺鍵，將探針固定在固相載體表面，即得。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征是步驟4)中還包括將探針與點樣液混合后再點樣在固相載體上，其中所述點樣液為5×SSC，0.1％SDS，5％甘油，1％Ficoll。

7.如權利要求6所述的制備方法，其特征是所述探針與點樣液的重量之比為1：1。

8.一種百合病毒的檢測方法，包括如下順序進行的步驟：

1)提取待測樣品的RNA；

2)首先對步驟1)提取得到的RNA進行逆轉錄，然后進行PCR擴增處理，得到擴增產物；

3)將擴增產物與雜交液混合均勻后涂布于上述百合病毒基因芯片上，在溫度為37-55℃下，進行雜交處理0.5-1.5h，得到雜交芯片；

4)將雜交芯片在激發波長540nm，發射波長570nm下進行掃描，觀察，獲取雜交信號并分析檢測結果。

9.如權利要求8所述的方法，其特征是步驟3)中所述雜交處理過程中保持溫度為37-55℃。

10.一種用于檢測百合病毒的試劑盒，其特征是包括：如權利要求1-4任一所述的基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交液、顯色試劑和說明書。