[發明專利]百合病毒基因芯片、制備方法及利用該基因芯片檢測百合病毒的方法

無效

• 申請號: 201410688135.1
• 申請日: 2014-11-25
• 公開（公告）號: CN104451893A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王進忠;賈慧;董金臯;郝少東;王升啟;張志勇;尚巧霞;楊寶東
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

技術領域

本發明涉及一種植物病毒基因芯片及其檢測方法，特別涉及一種能同時檢測多種百合病毒的基因芯片及其檢測方法，屬于微生物檢測領域。

背景技術

百合(Lilium)是集觀賞、食用、藥用于一身的重要經濟作物，現已成為國際上重要切花、觀賞花卉之一。近年來，隨著百合種植面積日益擴大，長期無性繁殖使病毒不斷積累；病毒病對百合的危害日趨嚴重，影響了百合的產量和品質，給百合種植業造成巨大的經濟損失。19世紀后期，病毒病幾乎把百合栽培種與品種推向滅絕。由于各地區栽培百合的種球來源不同，且大多缺乏嚴格的植物病毒檢疫控制，一般發病率在30％～50％，百合的抗病毒品種少、引種頻率高，鮮花進出口頻繁，加速了病毒的傳播。

國外已報道侵染百合的病毒有10種以上，危害較嚴重的有3種，其中主要的病毒有百合無癥病毒(Lily?symptomless?virus,LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus,CMV)和百合斑駁病毒(Lily?mottle?virus,LMoV)等。

當前我國百合切花生產用種球主要來源于荷蘭和國內自繁，為了防止百合病毒病隨著種球擴散與傳播，就必須加強百合檢疫和檢測。隨著分子生物學的迅速發展，許多生物化學及分子生物學技術被應用于植物病毒的診斷鑒定，給病毒分類鑒定提供了豐富可靠的手段。目前，檢測百合病毒的方法主要有酶聯免疫吸附測定(ELIASA)、電鏡技術和RT-PCR。這些技術在實際應用上有的方法提純過程繁瑣，耗時長；有的操作繁瑣，容易造成污染，出現假陽性；電鏡法鑒定植物病毒的優點是快速、簡單和直接，可以直觀地觀察病毒形態結構以及病毒侵染寄主后引起的細胞超微結構變化，但電鏡操作需要一定技能，而且工作比較集中，樣本數量不易太大；并且這些檢測方法工作量大、時間長、靈敏度差，難以檢測大量樣本。

近年來發展的基因芯片技術是一種高效、快速和可同時測定基因組成千上萬個基因活動的新方法，基因芯片技術是將無數預先設計好的寡核苷酸、cDNA、基因組DNA在芯片上做成點陣，與樣品中同源核酸分子雜交，對樣品的序列信息進行高效的解讀和分析，大規模獲取相關生物信息。該技術將大量的核酸分子同時固定于載體上，一次檢測、分析大量的DNA/RNA，解決了傳統核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目標分子數量少、成本高、效率低等的不足；而且，通過設計不同的探針陣列(array)，利用雜交譜重建DNA序列，還可以實現雜交測序，目前已廣泛應用于基因表達研究、疾病診斷、發現新基因及藥物篩選等各個領域,如：HBV、HIV、SARS等，動物病毒如口蹄疫、禽流感的醫學診斷。在植物病毒檢測中也扮演越來越重要的角色。Lee(2003年)設計了一種芯片可以檢測和區別4種感染葫蘆科植物的Tobamoviruses，他們將這些病毒的外殼蛋白基因克隆到載體中并用通用引物進行PCR，把得到的500bp～700bp的產物作為探針點在玻片上制成芯片，同時從植物中提取總RNA通過逆轉錄進行熒光標記。雜交結果顯示此芯片較好的檢測了葫蘆科植物所感染的不同病毒，并且表明雜交信號強度和探針與靶序列之間的相似程度有關。

鑒于基因芯片的高通量、微量化和多樣本同時檢測等特點，本發明以百合的3種病毒CMV、LSV、LMoV為研究對象，制備一種以RT-PCR為基礎的3植物病毒寡核苷酸檢測芯片，為實現植物病毒病多病原體多樣本同時檢測提供了基礎，為寡核苷酸基因芯片技術應用于植物病毒病檢測作了有益的探索和研究。

發明內容

本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題提供一種百合病毒基因芯片、其制備方法和利用該基因芯片檢測百合病毒的方法。本發明的基因芯片靈敏度高，選擇具有特異性的探針與擴增產物進行雜交，特異性強；用于檢測對百合切花影響和危害較為嚴重的3種病毒；本發明方法采用特定引物對百合樣品的RNA進行特異性PCR擴增，并用熒光標記擴增產物，基因芯片的探針與擴增產物雜交，避免了凝膠電泳對PCR產物進行檢測溶液導致假陽性的缺陷，本發明方法檢測速度快、穩定性好，成本低廉，適用于在短時間內準確檢測大量百合樣品。

為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種百合病毒基因芯片，包括固相載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述探針是選自百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒或百合斑駁病毒中的一種或多種病毒基因對應的核苷酸片段。

其中，所述固相載體是經過醛基化處理的玻片。

特別是，相鄰探針之間的間距為0.4-0.5mm，優選為0.45mm。