[發明專利]一種原位形成拉曼增強基底檢測水中大腸桿菌的方法

有效

• 申請號: 201410687082.1
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN104330399A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 陳章;李會東;李志賢;陳國梁
• 申請（專利權）人: 湖南科技大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術領域

本發明涉及一種原位形成拉曼增強基底檢測水中大腸桿菌的方法。

背景技術：

全世界每天有11億人等待安全用水，在發展中國家因飲用水大腸桿菌污染，導致數以萬計的人患病。十一五期間，我國突發環境事件中，7成涉及飲用水安全，其中不乏因大腸桿菌污染水體，影響飲用水安全，危害人體健康，阻礙經濟、社會的可持續發展。嚴峻的現實迫使研究者必須開發高效、快速、特異性檢測水中大腸桿菌的新方法和新技術，為保障人們用水安全，保護人體健康提供技術支持。

目前，對水環境中大腸桿菌的檢測方法主要包括常規培養檢測，分子生物學檢測、免疫檢測等。這些方法雖各具優勢，但也存在一些不足。常規培養檢測技術要求簡單，但首先需要對水體中致病菌進行培養，這個過程至少需要48-72h才能完成，檢測耗時、費力。分子生物學檢測常通過提取大腸桿菌DNA或者RNA，使用PCR技術對提取的核酸進行特異性擴增，然后通過檢測核酸實現對大腸桿菌的檢測，該方法檢測靈敏度高，特異性強，但無法實現現場分析檢測，不能夠實時評估水環境污染狀況。免疫檢測大腸桿菌雖然檢測特異性強，但檢測靈敏度較低。因此，開發簡單、易操作、特異性的檢測水中大腸桿菌的方法，對評估水環境污染程度，保障用水安全，促進經濟發展起著非常重要的作用。

發明內容：

本發明的目的是克服現有技術中方法的不足，提供一種原位形成拉曼增強基底的方法，利用氧化石墨烯和銀納米顆粒共同表面拉曼增強效應，實現對水中大腸桿菌的信號放大檢測。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案：一種原位形成拉曼增強基底的方法，包括以下步驟：

（1）選擇檢測大腸桿菌：使用LB培養基培養大腸桿菌，37℃條件下培養過夜，取細菌培養液，4000rpm/min離心5min，去除培養基，然后使用pH7.4?PBS緩沖液重懸菌體，稀釋菌體，等待檢測；

（2）原位形成拉曼增強基底：修飾有1μg/mL-10μg/mL葡萄糖氧化酶和0.1μg/mL-20μg/mL抗大腸桿菌抗體的0.1μg/mL-1μg/mL氧化石墨烯與大腸桿菌結合，2000rpm/min-3000rpm/min離心5min，收集菌體，pH7.4?PBS緩沖液重懸；加入0.5μg/mL-50μg/mL銀納米種子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化1μg/mL-50μg/mL葡萄糖，生成過氧化氫；過氧化氫與10μg/mL-50μg/mL銀離子反應，促進銀納米種子生長，形成銀納米顆粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增強基底；2000rpm/min-3000rpm/min離心5min，收集菌體，pH7.4?PBS緩沖液重懸。

（3）加入10μg/mL-20μg/mL拉曼報告分子，反應10min，?2000rpm/min-3000rpm/min離心5min，收集菌體，使用pH7.4?PBS緩沖液清洗菌體，2000rpm/min-3000rpm/min離心5min收集菌體，使用激光拉曼儀檢測拉曼報告分子的拉曼增強信號，拉曼信號強度與大腸桿菌濃度成正相關性，以此實現對水中大腸桿菌的信號放大檢測。

本發明利用氧化石墨烯表面的抗大腸桿菌抗體捕捉大腸桿菌，利用氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成過氧化氫促進銀納米種子生長，形成銀納米顆粒，吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增強基底，利用氧化石墨烯和銀納米顆粒共同表面拉曼增強效應，實現對水中大腸桿菌的信號放大檢測。該方法檢測靈敏度高，特異性強，可以進行現場分析檢測，實時評估水環境污染狀況，對評估水環境污染程度，保障用水安全，促進經濟發展起著非常重要的作用。

以下結合實施例和附圖進一步說明本發明，而非限制本發明。

附圖說明

圖1為原位形成拉曼增強基底檢測水中大腸桿菌原理圖；

圖2為檢測不同濃度大腸桿菌拉曼信號相對強度；

圖3為檢測相同濃度大腸桿菌和金黃色葡萄球菌拉曼信號相對強度。

具體實施案例：

實施例1

1、大腸桿菌選擇：

選取大腸桿菌O157:H7作為實施例檢測目標菌。使用LB培養基培養大腸桿菌O157:H7，37℃條件下培養過夜。取1mL細菌培養液，4000rpm/min離心5min，去除培養基，然后使用pH7.4?PBS緩沖液重懸菌體，稀釋菌體，最終菌體濃度為10⁴cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL以方便檢測。