[發明專利]一種環二肽的生產方法

有效

• 申請號: 201410686957.6
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104447759A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 張艷榮;劉婷婷;王大為;張雁南
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種環二肽的生產方法，其特征在于包括下列步驟：

(一)低溫保護氨基酸氨基

以L-組氨酸為原料，將其溶于水-四氫呋喃(v/v＝1:2)溶劑中，L-組氨酸的濃度為0.25～0.50mol/L，以二碳酸二叔丁酯[(Boc)₂O]為保護劑進行氨基保護，首先配制四氫呋喃-(Boc)₂O溶液，其中(Boc)₂O濃度為1～1.5mol/L，加到含L-組氨酸的pH8～9的堿水溶液中，His︰(Boc)₂O(mol/mol)＝1:(2～2.5)，-5℃～-10℃下攪拌反應15～30min，攪拌速率80～100r/min，然后升溫至30℃～40℃攪拌反應4～6h，反應結束后于溫度38℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓脫除有機溶劑，剩余物1:(18～20)(g/mL)比例加水溶解，用乙醚洗滌2～3次，每次洗滌時水相：乙醚相(v/v)＝2：1，脫除殘留的(Boc)₂O，然后于0℃條件下用質量濃度為50％的檸檬酸溶液調酸至pH3～4，得到游離的N^im-Boc-N^α-Boc-L-組氨酸，最后用乙酸乙酯萃取3～4次，每次萃取時水相/乙酸乙酯相(v/v)＝1︰1，萃取氨基被保護的后L-組氨酸，然后再于溫度35℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓蒸干脫除乙酸乙酯，得到氨基已被保護的L-組氨酸，此過程將L-組氨酸的N-端氨基和側鏈咪唑基用叔丁氧羰基(Boc-)保護，生成N^im-Boc-N^α-Boc-L-組氨酸；

(二)低溫保護氨基酸羧基

將L-脯氨酸懸浮于無水甲醇中，L-脯氨酸在無水甲醇中濃度為0.2～0.5mol/L，冷卻到0℃，向體系中通入干燥HCl氣體，通氣攪拌反應2～3h，攪拌速率為80～100r/min，反應結束后于溫度35℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓蒸發除去甲醇和過量的HCl，得到C-端羧基被保護的L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽；

(三)形成肽鍵

以二氯甲烷(DCM)為溶劑，將經過(一)、(二)制備的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸(N^im-Boc-N^α-Boc-L-His)溶于DCM，調整N^im-Boc-N^α-Boc-L-His在DCM中濃度為0.03～0.06mol/L的溶液，然后加入1-羥基苯并三氮唑HOBt制成混合液，將N'N-二環己基碳二亞胺DCC用DCM進行溶解，配制成DCC濃度為0.3～0.5mol/L的溶液，然后于-5℃～-10℃條件下將該溶液滴加到上述混合液中，攪拌反應20～30min，攪拌速率為80～100r/min，建立肽鍵形成反應體系，用等質量的三乙胺中和脯氨酸甲酯鹽酸鹽(Pro-OMe·HCl)，然后用定量濾紙過濾，濾液加入到上述肽鍵形成反應體系中，最后加入少量的三乙胺調整反應體系pH7～8后，然后升溫至35～40℃，以80～100r/min速率繼續攪拌反應2～4h，反應底物配比為：(N^im-Boc-N^α-Boc-L-His)︰(Pro-OMe·HCl)︰DCC︰HOBt(mol/mol)＝1︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)，反應結束后溶液用定量濾紙過濾，以除去副產物N,N’-二環己基脲(DCU)，然后于溫度26～30℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓濃縮，得到的濃縮物用乙酸乙酯溶解溶解，濃縮物︰乙酸乙酯(g/mL)＝1:(25～30)，過濾脫除殘余DCU，濾液依次用飽和NaCl溶液、飽和NaHCO₃溶液洗滌2～5次，每次乙酸乙酯相︰飽和NaCl或飽和NaHCO₃溶液(v/v)＝3︰(1～2)，最后用飽和NaCl洗至中性，除去剩余的DCU以及HOBt，然后采用硅膠柱層析純化，硅膠柱填料為粒度200～300目硅膠，洗脫劑為石油醚︰乙酸乙酯(v/v)＝8︰(2～3)，得到精制的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨酸甲酯(N^im-Boc-N^α-Boc-L-His-Pro-OMe)；

(四)氨基酸被保護氨基與羧基的選擇性脫除

稱取(三)制備的N^im-Boc-N^α-Boc-L-His-Pro-OMe溶于乙酸乙酯中，調整N^im-Boc-N^α-Boc-L-His-Pro-OMe濃度為0.1～0.3mol/L，于0℃條件下通入干燥的HCl氣體，攪拌反應30～45min，攪拌速率80～100r/min，反應結束后于溫度35℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓蒸脫溶劑，脫除Boc-保護基，得到保留C-端保護基的L-組氨酸-L-脯氨酸甲酯的鹽酸鹽；

(五)高溫高壓水相環化制備環二肽

將L-組氨酸-L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽(L-His-L-Pro-OMe·2HCl)懸浮于水中，配制成L-His-L-Pro-OMe·2HCl濃度為0.01～0.05mol/L的懸浮液，用NaHCO₃中和至pH6.0，釋放游離的L-組氨酸-L-脯氨酸甲酯，然后將溶液密封，在溫度130℃～136℃、壓力0.17～0.23MPa條件下進行環化反應2.5～3h。反應結束后溶液用定量濾紙過濾，濾液于溫度45～50℃、真空度為-0.1MPa條件下減壓濃縮，得到產物采用硅膠柱層析純化，層析柱填料為粒度200～300目硅膠，洗脫劑甲醇︰氯仿(v/v)＝1︰(4～5)，最終得到環(組氨酸-脯氨酸)二肽淡黃色固體。