[發明專利]一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法

有效

• 申請號: 201410685453.2
• 申請日: 2014-11-25
• 公開（公告）號: CN104387491B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 廖國陽;朱文勇;寸怡娜;李衛東;馬磊;鐘漢斌;代小虎;歐陽圣潔;王明清;管嬌瓊;胡文著;宋紹輝;蔡瑋;高菁霞;張新文;戴宗祥;姜述德
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司53100
• 代理人: 徐玲菊

技術領域

本發明屬于革蘭氏陰性細菌莢膜多糖技術領域，具體涉及一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法。

背景技術

b型流感嗜血桿菌(Hib)不僅是我國小兒化膿性腦膜炎的首要原因，而且是小兒肺炎的主要病因之一。近年來的研究表明，Hib已成為我國兒童呼吸道的首位致病菌，主要引起下呼吸道感染，以肺炎為主，2歲以下幼兒感染率較高，據估計，每年Hib在全球可引起至少300萬嚴重病例和大約38.6萬死亡，加之抗生素耐藥性菌株的不斷增加，接種疫苗成為預防絕大多數Hib嚴重病例的唯一公共衛生措施。WHO已經證明Hib結合疫苗的安全性和有效性，應將該疫苗納入全球兒童常規免疫規劃。

有莢膜的b型流感嗜血桿菌是致病的罪魁禍首，其莢膜上的b型莢膜多糖與致病力有很大關系。因此在Hib結合疫苗制備過程中其莢膜多糖的質量直接關系到疫苗最終的免疫原性及副作用的產生。根據2010版中國藥典可以知道，現行國內大部分的細菌類疫苗的莢膜多糖從粗多糖到精糖提純過程中普遍使用的是冷酚抽提法。該方法的主要缺點是苯酚的大量使用，苯酚屬高毒類物質，可通過皮膚、消化道、呼吸道吸收而出現全身中毒癥狀，短期接觸大量苯酚能引起中樞神經系統、肝腎、心肌、血液等多器官系統急性損害。苯酚對皮膚黏膜有強烈的腐蝕作用，皮膚接觸者除引起局部皮膚嚴重燒傷使皮膚腫脹、變黑壞死外，也可通過皮膚吸收進入體內而引起心、肝、腎、神經系統毒性作用。同時，含苯酚的廢液對自然環境的危害非常嚴重，如長期飲用苯酚污染的水，亦可引起慢性中毒反應，因此，要嚴格控制這些廢水進入環境。為此，人們正在尋找新方法來替代傳統工藝中這些危險有毒試劑的使用，這對于人類健康及自然環境的保護具有重要的現實意義。

傳統工藝中Hib莢膜多糖的制備參照公開文獻[Anderson et. al., INFERCTION AND IMMUNITY. 1977, 15(2):472-477]，采用CY培養基對Hib菌株37℃進行發酵，發酵液經甲醛滅活，離心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）進行沉淀，同時，在沉淀過程中有大量帶有負電荷的蛋白也被沉淀下來。然后用0.5～1M的NaCl對復合物沉淀進行解離，添加冰乙醇至終濃度25%（v/v），沉淀核酸，然后加冰乙醇至終濃度75%（v/v），沉淀得到粗多糖。粗多糖用醋酸鈉溶液溶解后，用冷酚抽多次抽提進行雜蛋白的去除，同時也去掉發酵過程中沒有被利用掉的氯化血紅素。最后超濾濃縮去除苯酚殘留，經75%（v/v）乙醇沉淀得到精糖。

目前主要是利用柱層析對多糖進行純化，2006年，Pato等人（Puri?cation of capsular polysaccharide from Neisseria meningitides serogroup C by liquid chromatography, Journal of Chromatography B, 832, 262–267）利用柱層析法對C群流腦莢膜多糖進行了純化研究，而國內研究人員[解紅艷 等, 層析法去除Ａ群流腦多糖疫苗粗糖中雜蛋白. 中國生物工程雜志, 2010, 30(8):88-92]對A群流腦莢膜多糖也進行了純化研究。雖然柱層析方法所得精糖檢測指標均符合要求，但此方法受層析柱載樣量的限制，大規模生產時花費時間較長，而且在Hib粗多糖中常含有大量的未被利用的氯化血紅素，其中的鐵離子容易與陰離子交換填料結合造成死吸附，填料的活化處理麻煩費時長，填料浪費較大。

因此，有必要研發一種不使用苯酚且工藝簡便的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法。

發明內容

為克服目前純化技術所存在的上述缺點，本發明提供了一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法，該制備工藝安全有效，對人體及環境無害。

本發明通過以下技術方案實現：一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a、將Hib粗多糖溶于體積濃度為3～30%的曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐溫-80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最終濃度為5～30mg/mL，攪拌過夜，得粗糖溶解液；

b、在步驟a所得粗糖溶解液中添加(NH₄)₂SO₄使使其質量濃度為20%～飽和，攪拌20～30分鐘后，在8000～10000rpm下進行離心分離20～40分鐘，取下層溶液；