[發明專利]環介導等溫擴增法檢測B群鏈球菌的引物組及試劑盒

有效

• 申請號: 201410682430.6
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104328212A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 楊煒華;汪運山;裴鳳艷;紀明宇;曹翠明;張芳;田娟娟
• 申請（專利權）人: 濟南市中心醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 趙妍

技術領域

本發明涉及一種環介導等溫擴增法檢測B群鏈球菌的引物組及試劑盒。

背景技術

B群鏈球菌(Group?B?Streptococcus，GBS)，又稱無乳鏈球菌，兼性厭氧，革蘭陽性鏈球菌，正常寄居于陰道和腸道，屬于條件致病菌。GBS感染引起肺炎、泌尿系統感染、軟組織感染、敗血癥等。GBS可引起新生兒、孕婦和老年人感染，是新生兒敗血癥和腦膜炎最常見的病原菌，以新生兒感染率最高。成年人的B鏈球菌群感染多發生于機體抵抗力低下時。GBS寄居于母親泌尿道和胃腸道的黏膜，孕婦帶菌率4％～40％不等，可能在生產過程中傳遞給他們的孩子。20世紀70年代，GBS感染成為導致新生兒早期死亡的主要原因，死亡率高達50％。GBS感染的新生兒，幸存者中30％-50％有嚴重的神經系統后遺癥，包括腦癱、腦積水、發育障礙、智力障礙、聽力或智力受損。GBS除了會造成新生兒感染外，懷孕婦女感染GBS會出現早產，早期破水、羊膜腔炎，產后子宮發炎，甚至流產、死產。GBS是圍產期女性泌尿生殖道感染和新生兒期重癥肺炎、敗血癥和腦膜炎的常見病原菌。新生兒的GBS感染具有發病迅速、病死率高的特點，是新生兒的主要死亡原因，已引起世界范圍內廣大學者的深切關注。對孕婦進行GBS篩查可及早發現感染，及時治療，有效控制GBS的危害。

細菌培養是檢測GBS的標準方法，但此菌營養要求較高，培養鑒定耗時較長，至少2d，且陽性率較低，給門診就醫患者帶來不便，尤其不能滿足孕檢篩查的需要。如何在感染早期快速、準確、靈敏的檢測GBS是臨床診斷關注的要點。

發明內容

本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種環介導等溫擴增法檢測B群鏈球菌的引物組及試劑盒。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種環介導等溫擴增法檢測B群鏈球菌的引物組，包括，特異性外引物F3：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；特異性外引物B3：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；特異性內引物FIP：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；特異性內引物BIP：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

一種環介導等溫擴增法檢測B群鏈球菌的試劑盒，包括裝有18μL反應液的反應管，裝有10μL?GBS?DNA的陽性對照管，裝有100μL無菌超純水的陰性對照管，所述反應液內含反應緩沖液、Bst?DNA聚合酶、顯色液、外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP；所述反應緩沖液各組分的濃度如下：400mM的Tris-Hcl，pH8.8；20mM的氯化鉀；20mM的硫酸銨；16mM的硫酸鎂和0.2％Tween₂₀、1.6M的甜菜堿、2.8mM×4種dNTP；Bst?DNA聚合酶的活性含量為：160單位/18μL；顯色液為：錳離子鰲和型鈣黃綠素，0.001μmol/18μL；F3：4pmol/18μL，B3：4pmol/18μL；FIP：32pmol/18μL，BIP：32pmol/18μL。

所述試劑盒中裝有18μL反應液的反應管為8個，裝有10μL?GBS?DNA的陽性對照管1個，裝有100μL無菌超純水的陰性對照DNA管1個。

所述試劑盒內還含20個適配1-10μl移液器的Tip頭。

上述試劑盒的使用方法：將2μL待檢DNA加入反應管內，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入GBS?DNA，陰性對照中加入無菌超純水，將反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為：60-65℃水浴恒溫反應30-40min，觀察顏色變化。

本發明的有益效果：

1.本試劑盒針對GBS基因中高度保守、特異的cAMP基因設計引物，采用環介導等溫擴增技術(LAMP)進行擴增并檢測。因為擴增效率高，特異性好，對DNA質量和數量要求不高，DNA提取過程簡單，不需要任何化學試劑，只需要沸水浴10min后離心即可，避免引入化學試劑對后續核酸擴增的影響，而且對儀器設備及操作要求低，簡化了操作過程，降低了檢測成本；

2.針對GBS基因中高度保守、特異的cAMP基因中的6個片段，自行設計并優選出特異性高、反應迅速、包含有4條引物的引物組，使得反應可在30-40min內完成；

3.將每個反應所需試劑預先混合并置于反應管中，檢測時只需要在反應管中加入樣本DNA即可進行反應，避免因多次加樣帶來的污染及誤差，對操作人員要求低；而且試劑盒中包含取樣所需移液器頭(Tip頭)，不需要另外準備耗材，進一步降低污染，提高檢測的精確度和便捷度；