[發明專利]一種金黃色葡萄球菌的快速檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201410682297.4
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104388565A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 張輝;陳曦
• 申請（專利權）人: 武漢明曼基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物分子檢測技術應用領域，具體涉及一種靈敏度高，特異性強的可視化金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒及其應用。?

背景技術

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）是一種重要的人畜共患病致病菌，可引起多種嚴重感染。金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，食品受污染的機會很多，是引起食物中毒的主要致病菌之一，是食品衛生標準中規定不得檢出的常見食物中毒致病菌。隨著抗生素的廣泛使用，出現了大量的耐藥金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌所引起的疾病已成為全球性的公共衛生問題，嚴重危害人類安全與健康。同時，金黃色葡萄球菌也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌，給養殖業造成巨大的經濟損失。目前我國對于金黃色葡萄球菌包括耐藥金黃色葡萄球菌的檢測方法以傳統的微生物培養、生化鑒定等為主，有必要建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法。?

環介導等溫擴增?(Loop-mediated?isothermal?amplification,?LAMP)技術是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法（國際專利公開號WO?00/28082），針對靶基因的6個位點設計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列，在1h內能達到10⁹靶序列拷貝，通過熒光染料顯色，在自然光下肉眼觀察判斷結果，適合于現場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。?

發明內容

本發明的一個目的是在于提供一種可視化金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒。根據金黃色葡萄球菌的nuc基因保守區序列設計環介導等溫擴增引物，應用PrimerExplorer?V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在線軟件設計特異性引物組，利用LAMP技術擴增靶基因的特定區域，從分子水平上實現金黃色葡萄球菌的快速檢測，為金黃色葡萄球菌檢測提供了有效且快速的核酸篩查檢測方法，可替代傳統的金黃色葡萄球菌的檢測方法，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。?

本發明的另一個目的是在于提供一種可視化金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒的應用，僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在2小時內，通過對樣品簡單的處理便可快速檢測樣品中是否含有金黃色葡萄球菌。?

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：?

一種可視化金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒

該試劑盒由反應預混液、熒光顯色劑、內蓋附有滅菌濾紙片的檢測管組成，其中的反應預混液包括Bst?DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、特異性引物組、甜菜堿和無菌雙蒸水。

所述特異性引物組包括外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1-4所示。?

一種可視化金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒的應用

使用方法包括細菌DNA的提取、環介導等溫擴增和顯色結果判定：

1、細菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即將樣品稀釋液煮沸，上清液作為環介導等溫擴增反應的DNA模板。

2、LAMP擴增：?

采用25μl反應體系：內引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP?1mM，甜菜堿0.5M，硫酸鎂6mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA?5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer?2.5μl，選擇64℃避光反應60分鐘。

3、檢測結果判定：?

將檢測管倒置甩動，使反應液與內蓋上的濾紙片充分混勻，室溫放置2分鐘；正置后用力甩動檢測管，使管內混有熒光顯色劑的反應液聚于檢測管底部，在比色卡背景下觀察反應液顏色：黃綠色則說明樣品中含有金黃色葡萄球菌，棕色則說明樣品中沒有金黃色葡萄球菌。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1、特異性好，能有效檢測樣本中是否存在金黃色葡萄球菌特定基因片段，進而確定樣本中是否存在金黃色葡萄球菌；

2、快速高效，能在不到2小時完成檢測（不包括樣品培養時間）；

3、不需要使用昂貴、精密的儀器設備，只需普通的金屬浴或水浴鍋，檢測成本低；

4、鑒定方便簡單，自然光下通過肉眼目測反應液顏色變化即可進行結果判斷；