[發明專利]一種L-天冬氨酸制取工藝

在審

• 申請號: 201410681746.3
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104531797A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 肖大年;張政;余煉
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12P13/20
• 分類號: C12P13/20;C12N11/02;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，特別是涉及一種L-天冬氨酸制取工藝。

背景技術

天冬氨酸又稱天門冬氨酸，是一種α-氨基酸，天冬氨酸的L-異構物是20種蛋白胺基酸之一，即蛋白質的構造單位，天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中。它是生物體內賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體，它可作為K+、Mg+離子的載體向心肌輸送電解質，從而改善心肌收縮功能，同時降低氧消耗，在冠狀動脈循環障礙缺氧時，對心肌有保護作用。它參與鳥氨酸循環，促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞，具有很好的醫藥價值，因此需求量很大，迫使其批量生產，申請號為CN200910033427.1一種利用富馬酸發酵液制備天冬氨酸酶以及L-天冬氨酸的方法，方法包括，一是富馬酸發酵液的清液部分培養大腸桿菌生產天冬氨酸酶，二是利用發酵液的固體沉淀部分富馬酸鈣與硫酸銨反應生成富馬酸銨,經過濃縮后在天冬氨酸酶的作用下生成L-天冬氨酸，該種方法實現了以糖基路線生產L-天冬氨酸，實現了富馬酸發酵液全利用以至達到節能減排的目標，有效的降低了L-天冬氨酸的生產成本，減少了對環境的污染，使得L-天冬氨酸得到可持續的生產，具有較廣的工業化生產前景，但是該種生產天冬氨酸的方法生產量小，無法滿足大量需求，并且抗原性強，穩定性弱，導致藥效差，限制了其使用范圍。

發明內容

為克服現有技術上的不足，本發明目的是提供一種L-天冬氨酸制取工藝。

為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：

一種L-天冬氨酸制取工藝，其工藝步驟如下：

(1)選育菌株：選用大腸桿菌作為天冬氨酸酶的來源，用肉汁培養基培養種子，接種與搖瓶培養基中，于32℃下振搖培養12h，逐級擴大培養至1000-2000L規模后，用1mol/L的HCl調pH至5.0，保溫42℃，2h后，冷卻至室溫，于轉筒式高速離心機內離心，收集含有天冬氨酸酶的菌體；

(2)細胞固定化：取大腸桿菌濕菌體15kg，懸浮于離心后的培養清液80L中或80L生理鹽水，保溫35℃再加入90L保溫35℃的18％明膠溶液和1.0％的戊二醛溶液，充分攪勻后，放置冷卻凝固，再放入0.25mol/L戊二醛溶液中浸泡，于5℃過夜后，再切成3–5mm3大小的小塊，并將其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5℃過夜，再取出以蒸餾水洗滌，濾干，得含天冬氨酸酶的固定化大腸桿菌，將其裝填到填充式生物反應器中，備用；

(3)轉化：取保溫32℃的1mol/L延胡索酸銨含1mmol/LMgCl2，pH為8.5底物的溶液，以一定的空間速度連續流過生物反應器，控制最大轉化率大于95％，得轉化液；

(4)修飾：取1g右旋糖苷溶于15ml蒸餾水，另取一定量NaIO4溶于10ml熱水中，將兩溶液混合，于4℃冰箱反應18h，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5LpH7.4的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液透析，將透析后的液體加入到步驟(3)的轉化液中，混合充分，得到混合液；

(5)制取粗品：向步驟(4)得到的混合液漸加入1mol/L的HCl，調pH至2.8，在保持5℃下放置過夜結晶,濾取結晶,用水洗滌，濾干,于105℃干燥，得L-天冬氨酸粗品；

(6)結晶：將粗品用稀氨水重結晶，先以氨水溶解成pH為5.0，濃度15％再加入1％活性炭，加熱70℃攪拌脫色2h后,趁熱過濾去渣，取濾液冷卻,保溫5℃過夜結晶,過濾取結晶,85℃真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。

優選的，所述步驟(1)中，所述培養基為斜面培養基。

優選的，所述步驟(4)中，所述修飾過程加入交聯劑。

有益效果：本發明通過選育菌株、細胞固定化、轉化、修飾、制取粗品、結晶六大步驟完成抗原性弱的L-天冬氨酸制取工藝，能夠在短時間內大量生產，修飾之后，抗原性弱，不會引起人體的免疫反應，藥效好，固定化生產，穩定性好，整個制取過程嚴格控制pH和溫度，并且通過固定化生產，致使生產的L-天冬氨酸穩定性好，循環有效批量生產，在修飾步驟中，選用NaIO4作為氧化劑，其氧化性強，指示性好，方便快捷地使L-天冬氨酸得到修飾，加入的交聯劑使修飾反應更加容易地進行，制取粗品之后，通過結晶精制產品，保證了產品的純度，使其在發揮作用時，藥效更好，斜面培養基使大腸桿菌附著容易，而且便于提取工作，本工藝使L-天冬氨酸的短時間內大量生產，極大滿足人們的需求，適于推廣使用。

具體實施方式