[發明專利]應用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法

有效

• 申請號: 201410680168.1
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN105699497B
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 劉玉潔;梁鑫淼;于龍;付冬梅;肖遠勝
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/08
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.應用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步驟如下：

a. 以經過化學改性的硅膠為基質，伴刀豆凝集素 concanavalin A (Con A)為配基，制備硅膠凝集素親和材料 SG Con A；

b. 將硅膠凝集素親和材料SG Con A 裝填為色譜柱，在高效液相色譜模式下，樣品中的糖蛋白或糖肽的色譜富集條件，淋洗液和洗脫液 pH 值 5-8，鹽濃度 0.01-1.0 M，溫度4-60℃；

所述步驟 b:其中 Con A 特異性結合甘露糖型和葡萄糖型的聚糖，不結合復雜型的聚糖，同時對高甘露糖型有特異性強結合，以不含有糖的人血清蛋白(HSA), 含有高甘露糖型的核糖胰蛋白酶 B (RNase B)和含有復合糖型的雞卵清糖蛋白 (ovalbumin)作為色譜評價對象，評價凝集素親和材料的富集性能；

所述色譜富集條件為：

1）為淋洗液為 A 相，洗脫液為 B 相，溫度為 4-60℃， 0-10 min, 100 % A, 10-12min, 0-100% B, 12-22 min, 100 % B, 22-25 min, 0-100 % C, 25-35 min, 100% C,35-37 min, 0-100% A, 37-45 min, 100% A； 淋洗液 A 相為磷酸鹽(PBS)緩沖溶液，并含有 0.01M-1M 的 NaCl，0.01-50 mM CaCl2, 0.01-50 mM MgCl₂, 0.01-50 mM MnCl₂, pH5-8；洗脫液B 為含有 0.01 M-1.0 M 競爭性糖的緩沖溶液，競爭性洗脫試劑為甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖，糖的濃度 0.01-1.0 M，并含有 0.01M-1M 的 NaCl，0.01-50 mM CaCl₂, 0.01-50 mM MgCl₂, 0.01-50 mM MnCl₂, pH 值 5-8；

或2） 為: 取親和材料 SG Con A 1-2mg，裝填于 Zip-tip 小柱中，淋洗液為 A相；洗脫液為B相，取糖肽 1-10 μg，經過A 溶液的上樣、淋洗和B 溶液的洗脫, 分別收集上樣液、淋洗液和洗脫液; 所述淋洗液 A 相為磷酸鹽(PBS)緩沖溶液，并含有 0.01M-1.0 M 的NaCl，1-10 mM CaCl₂, 1-10 mM MgCl₂, 1-10 mM MnCl₂, pH 5-8；所述洗脫液 B 相為含有0.01 M-1.0 M 競爭性糖的磷酸鹽緩沖溶液, 競爭性糖為甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖；

c. 制備糖蛋白/糖肽：將所得糖蛋白或糖肽餾分經過脫鹽，PNGase F 酶解、或trypsin 酶解脫鹽后再經過 PNGase F 酶解 釋放出糖鏈，并再次脫鹽，應用親水性材料富集聚糖；步驟 c 中脫鹽過程為： 1）. 用透析袋透析脫鹽，透析袋截留糖蛋白的分子量1000-20000 Da； 或 2）. 應用反相色譜柱脫鹽，流動相條件: 反相 C18 色譜柱，100-500?，5-50 μm，A 相為水含有 0.1% 甲酸(FA)，B 相為乙腈含有0.1%甲酸 (FA), 洗脫梯度為1-10 min, 100% A, 10-20min, 80% B 體積濃度, 接收10 min 以后的餾分，將所接餾分離心濃縮后，低溫保存。

2.按照權利要求 1 所述的方法制備 SG Con A 材料，其特征在于： 步驟 a：經過化學改性的硅膠含有一定碳鏈長度的間隔臂，間隔臂含有 3~12 個碳原子，其一端和硅膠相連，末端為含有 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的官能團。