[發明專利]一種大腸菌群的快速檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201410679235.8
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104450896A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 張輝;陳曦
• 申請（專利權）人: 武漢明曼基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物分子檢測技術應用領域，具體涉及一種靈敏度高，特異性強的可視化大腸菌群環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒及其應用。

背景技術

大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：一群在36℃條件下培養24h能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌除包括大腸桿菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸椽酸菌屬、克雷伯菌屬。

大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染，推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性。快速檢驗大腸菌群，有助于食品的衛生管理，維護消費者的健康安全。現有的檢測方法主要是傳統的細菌培養計數及其改進方法，有必要建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法。

環介導等溫擴增?(Loop-mediated?isothermal?amplification,?LAMP)技術是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法（國際專利公開號WO?00/28082），針對靶基因的6個位點設計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列，在1h內能達到10⁹靶序列拷貝，通過熒光染料顯色，在自然光下肉眼觀察判斷結果，適合于現場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。

發明內容

本發明的一個目的是在于提供一種可視化大腸菌群環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒。根據腸桿菌科的16s?rDNA基因保守區序列設計環介導等溫擴增引物，應用PrimerExplorer?V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在線軟件設計特異性引物組，利用LAMP技術擴增靶基因的特定區域，從分子水平上實現大腸菌群的快速檢測，為大腸菌群檢測提供了有效且快速的核酸篩查檢測方法，可替代傳統的大腸菌群的檢測方法，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

本發明的另一個目的是在于提供一種可視化大腸菌群環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒的應用，僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在2小時內，通過對樣品簡單的處理便可快速檢測樣品中的大腸菌群是否合格。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種可視化大腸菌群環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒

該試劑盒由反應預混液、熒光顯色劑、內蓋附有滅菌濾紙片的檢測管組成，其中的反應預混液包括Bst?DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、特異性引物組、甜菜堿和無菌雙蒸水。

所述特異性引物組包括外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1-4所示。

一種可視化大腸菌群環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒的應用

使用方法包括待檢樣品中細菌DNA的提取、環介導等溫擴增和顯色結果判定：

1、待檢樣品中細菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即將樣品稀釋液煮沸，上清液作為環介導等溫擴增反應的DNA模板。

2、LAMP擴增：

采用25μl反應體系：內引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP?1mM，甜菜堿0.5M，硫酸鎂6mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA?5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer?2.5μl，選擇64℃避光反應60分鐘。

3、檢測結果判定：

將檢測管倒置甩動，使反應液與內蓋上的濾紙片充分混勻，室溫放置2分鐘；正置后用力甩動檢測管，使管內混有熒光顯色劑的反應液聚于檢測管底部，在比色卡背景下觀察反應液顏色：黃綠色則說明樣品中的大腸菌群不合格，棕色則說明樣品中的大腸菌群合格。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1、特異性好，能有效檢測樣本中是否存在大腸菌群特定基因片段，進而確定樣本中是否存在大腸菌群；

2、快速高效，能在不到2小時完成檢測；

3、不需要使用昂貴、精密的儀器設備，只需普通的金屬浴或水浴鍋，檢測成本低；

4、鑒定方便簡單，自然光下通過肉眼目測反應液顏色變化即可進行結果判斷；

5、整個過程不涉及有毒試劑，保證了操作人員及環境的安全。