[發明專利]異尖線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410676272.3
• 申請日: 2014-11-21
• 公開（公告）號: CN104561265A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 黃達娜;張仁利;陽帆;吳春利;李玥;武偉華;耿藝介;李曉恒;高世同
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于分子生物檢測技術領域，具體涉及一種異尖線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

隨著鮮食生魚的飲食時尚的興起,異尖線蟲病已成為重要的食源性人獸共患寄生蟲病。為了解海產品異尖線蟲感染狀況，有必要對市面上流通的海產品進行異尖線蟲的檢測。但傳統的檢測方法主要通過形態學鑒定技術，操作繁瑣，比較耗時，檢出率低。

相比傳統檢測方法的缺點，現有采用的生物分子檢測方法，多通過對待側樣本的前處理、核酸提取、凝膠電泳等步驟進行，但該方法實施過程中凝膠電泳的操作,容易出現假陽性結果，同時過程也比較繁瑣。

發明內容

本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種光學系統檢測熒光信號減少了假陽性、縮短了檢測時間的異尖線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

一種異尖線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括PCR特異性引物和熒光探針；其中，

所述PCR特異性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；

所述熒光探針具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且所述熒光探針5’端標記熒光報告基團、3’端標記熒光淬滅基團。

本發明的試劑盒，使用時對從待測標樣提取的DNA進行PCR擴增，檢測擴增過程中的熒光變化，即可實現異尖線蟲的檢測；檢測過程是實時反映靶基因擴增的過程，并根據內參或外參直接反映出靶基因的拷貝數；相比現有的方法，具有靈敏度高、特異性強、周期短、高通量等優點，同時通過光學系統檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，既減少了假陽性的發生率和對人、環境的潛在危害，同時縮短了檢測時間。

本發明進一步還提出一種異尖線蟲的實時熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：

提取待測樣本DNA；

以提取的待測樣本DNA為模板進行實時熒光PCR；其中所述實時熒光PCR過程中采用的引物為具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；所述實時熒光PCR過程中采用的熒光探針為具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列的熒光探針，且所述熒光探針5’端標記熒光報告基團、3’端標記熒光淬滅基團；

檢測PCR過程中的熒光信號。

本發明的檢測方法，通過特異性設計的靈敏性引物和探針，對從待測標樣提取的DNA進行PCR擴增，檢測擴增過程中的熒光變化，即可實現異尖線蟲的檢測；檢測精度高、結果準確，且過程快速簡便。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1為本發明以華支睪吸蟲、廣州管圓線蟲、弓形體、日本血吸蟲、異尖線蟲、衛氏并殖吸蟲為待測標樣進行檢測的熒光變化圖；

圖2為本發明的以華支睪吸蟲、廣州管圓線蟲、弓形體、日本血吸蟲、異尖線蟲、衛氏并殖吸蟲為待測標樣擴增產物的電泳結果圖；

圖3為靈敏性實驗分析驗證本發明方法的靈敏性過程中的熒光變化圖；

圖4為靈敏性實驗分析驗證本發明方法的靈敏性結果的線性曲線；

圖5為靈敏性實驗分析驗證本發明方法的靈敏性結果的數據表。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明實施例提供一種異尖線蟲的實時熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：

S10，獲取待測樣本，并提取待測樣本DNA；

S20，以提取的待測樣本DNA為模板進行實時熒光PCR；

S30，檢測PCR過程中的熒光信號。

本發明上述過程通過對待測的DNA樣本進行擴增，并通過擴增過程中熒光探針產生的熒光信號變化，從而便可以得知待測樣本是否含有目標病原體；其中，在步驟S20的實時熒光PCR中采用的特異性引物和熒光探針如下：