[發(fā)明專利]一種新型抗菌肽Hep-W及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410673569.4
• 申請(qǐng)日: 2014-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN104945497A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張文薈;鐘誠(chéng);鄧文穎;吳慶儒;蔣正芳;趙燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京國(guó)龍生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/47
• 分類號(hào): C07K14/47;C12N15/12;C12N15/81;A23K1/17;A23K1/18;A61K38/17;A61P31/04;C12R1/84
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是，涉及一種新型抗菌肽Hep-W及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗菌肽是動(dòng)物體內(nèi)極為重要的先天免疫物質(zhì)，是一種具有廣譜抗菌、抗病毒甚至抗寄生蟲活性的陽(yáng)離子短肽。關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)制，目前普遍認(rèn)可的是抗菌肽的膜攻擊學(xué)說(shuō)，即通過正負(fù)電荷相吸原理作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，引起膜通透性改變，或在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，最后導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而死亡。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制，如果細(xì)菌要產(chǎn)生耐藥性，必須改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)的改變對(duì)細(xì)菌本身有著更大的生命威脅，因此細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能微乎其微。因此，抗菌肽自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的最佳替代品，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)等領(lǐng)域。

然而，天然抗菌肽并非完美無(wú)缺，大部分天然抗菌肽的抗菌活性不高，部分抗菌肽在與細(xì)胞膜相互作用的過程中對(duì)真核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性也限制了抗菌肽在臨床上的應(yīng)用。因此，在尋找活性更強(qiáng)，無(wú)溶血或細(xì)胞毒作用的抗菌肽的同時(shí)也開始致力于對(duì)原有的天然抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或重新設(shè)計(jì)，抗菌肽分子設(shè)計(jì)是基于抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過一系列生物信息學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然抗菌肽的定向改造或全新設(shè)計(jì)，以獲得更加符合人們需要的抗菌肽類抗生素。

來(lái)自豬體內(nèi)的抗菌肽(Hepcidin)是一種富含半胱氨酸的小分子多肽，既具有一定的抑菌活性，又具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝的功能，其潛在的醫(yī)用價(jià)值成為近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。但通過化學(xué)合成或從組織中提取獲得該抗菌肽的成本太高，得率低且工序繁瑣，因此，利用生物技術(shù)在體外獲得大量抗菌肽成為當(dāng)前的一個(gè)首選方法。巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達(dá)系統(tǒng)作為近幾年新興的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，已表現(xiàn)出相當(dāng)大的潛力，彌補(bǔ)了原核系統(tǒng)的一些缺陷。有研究表明直接從豬的肝臟中提取出天然抗菌肽(Ifepcidin)基因，與pGAPZαA載體相連后轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中，雖然抗菌肽目的基因?qū)腧?yàn)證成功，可是卻沒有發(fā)現(xiàn)其抑菌活性。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型抗菌肽Hep-W及其制備方法和應(yīng)用，在分析豬抗菌肽(Hepcidin)理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過分子設(shè)計(jì)對(duì)Hepcidin進(jìn)行分子改建，獲得了在抗菌活性及細(xì)胞毒性方面表現(xiàn)俱佳、且具有獨(dú)特膜作用機(jī)制的改建抗菌肽Hep-W。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種新型抗菌肽Hep-W，所述抗菌肽Hep-W氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

優(yōu)選的，所述新型抗菌肽Hep-W核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

一種新型抗菌肽Hep-W的制備方法，包括以下步驟：

1)新型抗菌肽Hep-W基因的設(shè)計(jì)與合成：參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，對(duì)豬成熟肽Hepcidin的基因進(jìn)行改造，改造并合成新型抗菌肽Hep-W基因；

2)新型抗菌肽Hep-W表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定；將新型抗菌肽Hep-W基因序列與pGAPZαA相連接獲得的表達(dá)載體pGAPZαA-Hep-W在感受細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，對(duì)表達(dá)后的表達(dá)載體pGAPZαA-Hep-W進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，獲得測(cè)序正確的表達(dá)載體；

3)新型抗菌肽Hep-W真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將測(cè)序正確的表達(dá)載體pGAPZαA-Hep-W轉(zhuǎn)入畢赤巴斯德酵母，獲得重組酵母菌，對(duì)重組酵母菌進(jìn)行鑒定；

4)新型抗菌肽Hep-W的獲得：將鑒定正確的重組酵母菌培養(yǎng)后進(jìn)行滅活、破碎并純化，即獲得新型抗菌肽Hep-W。

進(jìn)一步，所述步驟2)、3)中鑒定過程采用的引物對(duì)上下游引物序列分別為SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4。

進(jìn)一步所述步驟3)種表達(dá)載體pGAPZαA-Hep-W通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤巴斯德酵母。

新型抗菌肽Hep-W作為畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預(yù)防和治療的應(yīng)用。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明中新型抗菌肽Hep-W在抗菌活性及細(xì)胞毒性方面表現(xiàn)俱佳、且具有獨(dú)特膜作用機(jī)制；

2、本發(fā)明中抗菌肽Hep-W具有良好的抑菌活性及熱穩(wěn)定性，并且溶血性低，即使是高濃度的雜合抗菌肽對(duì)紅細(xì)胞也幾乎沒有破壞作用，安全性得到大大提高；

3、本發(fā)明中抗菌肽Hep-W對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性大大提高；

4、本發(fā)明中抗菌肽Hep-W制備方法簡(jiǎn)單，易純化，成本低，利于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明