[發明專利]番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法

在審

• 申請號: 201410671396.2
• 申請日: 2014-11-21
• 公開（公告）號: CN104480189A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 丁錦平;裴冬麗;李成偉;洪權春;侯穎;張慶琛;李瑞麗
• 申請（專利權）人: 商丘師范學院
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張真真

技術領域

本發明涉及了一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，特別涉及一種番茄黃萎病抗性離體鑒定的侵染源、接種數量和方法。

背景技術

番茄黃萎病是保護地和露地番茄生產的重要病害之一。可大幅度降低番茄的產量和品質，是番茄生產的一個主要限制因素。病原（Vertillium?dahliae），半知菌亞門、淡色孢科、輪枝菌屬。該病具有潛伏侵染和連續發作等特點，一旦發病，無藥可治，番茄黃萎病多發生于番茄生長后期，葉片由下向上逐漸變黃，首先是葉緣變色，變色沿葉脈擴大，輪廓清晰，成為“V”形黃斑，以后下部葉片明顯枯死。發病重的結果小或不能結果，剖開病株莖部，維管束變淺褐色，病株并不迅速枯死，而是逐漸落葉，表現慢性的向上枯死。因此，鑒定番茄黃萎病抗性種質，培育抗性品種，是防治黃萎病的重要舉措。目前黃萎病抗性鑒定多用分生孢子做侵染源侵染活體植株。尤海波等(2003)研究結果表明2片真葉接種黃萎病菌，接種濃度為10^?7孢子／ml，采用浸根接種法，浸根20min，溫度為20～30℃，15d調查。尤海波(2003)對98份番茄材料進行了抗病性篩選。篩選出了2份免疫材料。3份高抗材料及46份抗病材料和2l份耐病材料，其中抗病材料占大多數。苗期鑒定方法由于受環境因素影響較大，很難快速鑒定出抗病材料。而鑒定栽培品種的抗性資源及抗性基因，通過育種使基因積聚，是今后抗性育種的重要方向。因此，發展一種合適的抗性鑒定方法，鑒定不同品種的抗性，培育抗性品種，是十分必要的。

發明內容

本發明所解決的問題是目前黃萎病抗性鑒定多用分生孢子做侵染源，侵染植株幼苗，一方面由于苗期植物生長比較敏感受環境影響較大，導致鑒定結果可靠性不高；另一方面是分生孢子的數量對發病的速度、發病程度影響較大，難以控制最佳的分生孢子濃度抗性。本發明提供一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，用培養的分生孢子使之處于萌發狀態，侵染離體的組織，不僅符合黃萎病侵染的規律，而且致病力適中，發病均勻，植物體選擇番茄生長期的葉片，環境條件易于控制，可以較好的、快速的鑒定番茄品種對黃萎病的抗性。

本發明的技術方案是：一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，它的步驟如下：

（1）從番茄上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，培養侵染的黃萎病菌分生孢子，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液；

（2）用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片；

（3）統計葉片發病情況，劃分抗性等級。

所述步驟（1）中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液的方法如下：

①?將黃萎病菌分生孢子接種于PDA培養基上，置恒溫光照培養箱中，25℃光照恒溫培養30天；

②?將步驟①中成熟的分生孢子取下，在無菌的條件下，置滅菌的研缽中研碎，加入PDA液體培養基；

③?將步驟②中PDA液體培養基轉入45ml離心管中，置離心機中，再1800轉/分鐘的條件下離心5分鐘；

④?取步驟③離心管中的PDA液體培養基的上清液，轉入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計數板置400倍顯微鏡計算黃萎病菌分生孢子濃度，然后將懸浮液調節至1×10⁶個/毫升；

⑤?將步驟④中懸浮液置25℃恒溫振蕩搖床中，在200轉/分鐘的條件下培養12小時；

⑥?將步驟⑤中培養后的懸浮液再2000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸沉淀，將黃萎病菌分生孢子濃度調節至1×10⁶個/毫升，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液。

所述步驟①中PDA培養基的配方為：去皮馬鈴薯：?200g，蔗糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml，操作步驟：將去皮馬鈴薯切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣；向濾液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，定容至1000ml；將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min；在無菌條件下，將25ml融化的培養基倒入培養皿中，冷卻凝固，編號待用。

所述步驟②中PDA液體培養基的配方為：去皮馬鈴薯：?200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，操作步驟：將去皮馬鈴薯，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣；向濾液中加入葡萄糖，加熱融化，定容至1000ml；將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min，待用。