[發明專利]番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法

在審

• 申請號: 201410671396.2
• 申請日: 2014-11-21
• 公開（公告）號: CN104480189A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 丁錦平;裴冬麗;李成偉;洪權春;侯穎;張慶琛;李瑞麗
• 申請（專利權）人: 商丘師范學院
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張真真

1.一種番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于，它的步驟如下：

（1）從番茄上分離的黃萎病病菌分生孢子做侵染源，培養侵染的黃萎病菌分生孢子，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液；

（2）用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片；

（3）統計葉片發病情況，劃分抗性等級。

2.根據權利要求1所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于：所述步驟（1）中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液的方法如下：

①?將黃萎病菌分生孢子接種于PDA培養基上，置恒溫光照培養箱中，25℃光照恒溫培養30天；

②?將步驟①中成熟的分生孢子取下，在無菌的條件下，置滅菌的研缽中研碎，加入PDA液體培養基；

③?將步驟②中PDA液體培養基轉入45ml離心管中，置離心機中，再1800轉/分鐘的條件下離心5分鐘；

④?取步驟③離心管中的PDA液體培養基的上清液，轉入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計數板置400倍顯微鏡計算黃萎病菌分生孢子濃度，然后將懸浮液調節至1×10⁶個/毫升；

⑤?將步驟④中懸浮液置25℃恒溫振蕩搖床中，在200轉/分鐘的條件下培養12小時；

⑥?將步驟⑤中培養后的懸浮液再2000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸沉淀，將黃萎病菌分生孢子濃度調節至1×10⁶個/毫升，得到侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液。

3.根據權利要求2所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于：所述步驟①中PDA培養基的配方為：去皮馬鈴薯：?200g，蔗糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml，操作步驟：將去皮馬鈴薯切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣；向濾液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，定容至1000ml；將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min；在無菌條件下，將25ml融化的培養基倒入培養皿中，冷卻凝固，編號待用。

4.根據權利要求2所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于：所述步驟②中PDA液體培養基的配方為：去皮馬鈴薯：?200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，操作步驟：將去皮馬鈴薯，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣；向濾液中加入葡萄糖，加熱融化，定容至1000ml；將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min，待用。

5.根據權利要求1所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于：所述步驟（2）中用侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液接種離體的番茄葉片的方法如下：選取番茄品種，將番茄的離體葉片葉柄插入步驟⑥中侵染的黃萎病菌分生孢子懸浮液中，待黃萎病菌分生孢子懸浮液液吸收完全后，將離體葉片葉柄插入滅菌水中培養，在培養箱中25℃恒溫培養七天。

6.根據權利要求2所述的番茄黃萎病抗性的離體鑒定方法，其特征在于：所述步驟（3）中用抗性等級劃分如下：

0?級：葉片正常，無病癥；

Ⅰ?級：葉片稍微有些變軟；

Ⅱ?級：發病部位面積小于整個葉片的1/4或中度萎蔫；

Ⅲ?級：發病部位面積大于1/4小于3/4或出現嚴重萎蔫；

Ⅳ?級：葉片枯死或發病部位面積大于3/4。