[發明專利]一種低拷貝pTerm質粒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410670147.1
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104404069B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 薛高旭;馮愛華;孫中平;廖國娟
• 申請（專利權）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司11250
• 代理人: 張建綱

1.一種低拷貝pTerm質粒，其特征在于，所述質粒由rop基因、rep基因、原核生物轉錄終止子、多克隆位點以及抗生素抗性基因組成；在所述多克隆位點的兩端分別設置至少一個所述原核生物轉錄終止子；所述原核生物轉錄終止子為不依賴ρ因子的原核生物轉錄終止子；所述抗生素抗性基因為Amp基因或Kan基因。

2.根據權利要求1所述的低拷貝pTerm質粒，其特征在于，所述Amp基因如SEQ ID No.1所示的序列結構，所述Kan基因如SEQ ID No.4所示的序列結構。

3.根據權利要求1或2所述的低拷貝pTerm質粒，其特征在于，所述質粒的拷貝數為40-60個。

4.根據權利要求3所述的低拷貝pTerm質粒，其特征在于，所述質粒記為pTerm-LA，如SEQ ID No.7所示的序列結構；所述質粒中，自5’端第120bp～713bp為Terminator基因；869bp～1729bp為Amp基因；1878bp～2506bp為rep基因；3231bp～3455bp為rop基因；其中多克隆位點在427bp～468bp處；或者

所述質粒記為pTerm-LK，如SEQ ID No.8所示的序列結構；所述質粒中，自5’端第120bp～713bp為Terminator基因；869bp～1684bp為Kan基因；1833bp～2461bp為rep基因；3186bp～3410bp為rop基因；其中多克隆位點在427bp～468bp處。

5.一種構建根據權利要求1-4任一所述的低拷貝pTerm質粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：人工設計并合成rep基因、rop基因、含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段以及抗生素抗性基因片段；所述含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段中在所述多克隆位點的兩端分別設置至少一個所述原核生物轉錄終止子；

步驟二：運用多段重組法將所述的rep基因、rop基因、含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段以及抗生素抗性基因片段連接環化，最終得到環形的質粒。

6.根據權利要求5所述的低拷貝pTerm質粒的構建方法，其特征在于，所述的多段重組法為Gibson重組方法，反應體系及條件：按1:1:1:1的摩爾比取所述rep基因、rop基因、含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段以及抗生素抗性基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50℃下反應至得到環形質粒。

7.一種構建權利要求1-4任一所述的低拷貝pTerm系列質粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段；

步驟二：按照權利要求5或6所述方法構建得到含所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因的pTerm質粒，分別以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的質粒為模板，F-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK為引物,通過PCR擴增得到rop-rep-含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段；所述引物F-pTerm-LA/LK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3’；所述引物R-pTerm-LA/LK：5’-actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc-3’；所述含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段中在所述多克隆位點的兩端分別設置至少一個所述原核生物轉錄終止子；

步驟三：運用Gibson重組方法，將構建的所述rep-rop-含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段分別與所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段進行組裝。

8.根據權利要求7所述的低拷貝pTerm質粒的構建方法，其特征在于，所述的Gibson重組方法反應體系及條件：按1:1的摩爾比取所述rep-rop-含有原核生物轉錄終止子和多克隆位點的基因片段分別與所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50℃下反應至得到環形質粒。

9.權利要求1-4任一所述低拷貝pTerm質粒在基因克隆、篩選和測序領域中的應用。