[發明專利]一種低拷貝pTerm質粒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410670147.1
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104404069B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 薛高旭;馮愛華;孫中平;廖國娟
• 申請（專利權）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司11250
• 代理人: 張建綱

技術領域

本發明屬于生物技術領域和基因工程領域，具體涉及一種低拷貝、大容量、高穩定性的pTerm質粒及其構建方法和應用。

背景技術

質粒是染色質外的遺傳因子，能夠進行自主復制，是一種能獨立復制的復制子。質粒是一種雙鏈共價閉合環形DNA分子，可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2kb～300kb之間。

質粒雖然不是宿主生存所必需的遺傳元件，但是能夠給予宿主細胞某些特殊的性質，例如抗藥性等。質粒可以作為載體用于克隆外源基因，廣泛應用于基因克隆、測序及基因合成等領域。人們一方面不斷從自然界發現新質粒，另一方面也不斷在已有質粒的基礎上構建衍生質粒，作為基因工程的載體。

所謂復制子，即是一個遺傳單位，包括DNA復制起點(ori)及其相關的調控原件。每個質粒DNA上都含有ori，在質粒中ori是一段特定的DNA序列，長約幾百堿基對，只有ori能被宿主細胞復制及蛋白質識別的質粒才能在該種細胞中復制，不同質粒復制控制狀況主要與ori的序列結構相關。

根據質粒復制的特點，質粒被分為嚴緊型和松弛型兩類。嚴緊型質粒也稱低拷貝數質粒，每個細胞中拷貝數有限，大約一個至十幾個；松弛型質粒也稱高拷貝數質粒，其拷貝數較多，可達幾百個。恒定的拷貝數與質粒復制控制系統、宿主細胞遺傳背景及生長條件有關。尤其是高拷貝數質粒更是因其分子量小、拷貝數高、操作方便、易于大量制備等優點而成為實驗中的首選。

松弛型質粒(高拷貝數質粒)通常帶有藍白斑篩選功能(例如pUC系列載體)，這個特點給基因克隆帶來了極大的方便。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz＇的基因，lacz＇中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子序列；編碼α肽鏈的序列；一個多克隆位點(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的序列中，是外源DNA的插入位點。設計適用于藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽(即α肽鏈)，從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產生藍色物質。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacz'的質粒后，質粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用，能夠使X-gal生成藍色物質，這種現象即α-互補。以上是攜帶空載體的菌株產生的表型。當外源DNA與含lacz'的載體連接時，會插入進MCS，使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達α肽鏈，將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用，不產生有活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養基中的X-gal產生藍色，培養表型呈現白色菌落。

雖然帶有藍白斑篩選功能的高拷貝數質粒給基因克隆提供了極大的方便，但是其β-半乳糖苷酶的啟動子屬于強啟動子，能夠大量啟動外源基因的轉綠、翻譯，這也導致了某些結構復雜的基因、轉錄或翻譯產物對宿主有毒性的基因無法克隆。目前通常使用以下兩種方式克隆這類“難度”基因：①選用低拷貝或單拷貝質粒作為克隆載體；②選用可以降低質粒拷貝數的菌株，例如EPI400。盡管這些方法可以成功克隆部分“難度”基因，但是仍有很多基因無法克隆，究其原因是因為這些載體盡管拷貝數低，但是通常還是帶有藍白斑篩選功能，仍具有大量啟動外源基因的轉綠、翻譯的強啟動子，并且即使質粒中不帶有藍白斑篩選功能，不具有相應的強啟動子，質粒中其它啟動子(例如抗生素抗性基因啟動子)也可以啟動外源基因的低量轉錄、翻譯，因此，如何克服現有質粒載體存在的上述缺陷，提高克隆“難度”基因的成功率是很多科研人員需要解決的首要問題。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種低拷貝、大容量、高穩定性的pTerm系列質粒，并進一步公開其構建方法及應用。

本發明的目的將通過以下技術方案得以實現：

一種低拷貝pTerm質粒，所述質粒包括rop基因、rep基因、原核生物轉錄終止子以及抗生素抗性基因；所述原核生物轉錄終止子設置于多克隆位點的兩端；所述抗生素抗性基因為Amp基因或Kan基因。

優選的，所述Amp基因具有如SEQ ID No.1所示的序列結構，所述Kan基因具有如SEQ ID No.4所示的序列結構。

優選的，所述質粒的拷貝數為40-60個。