[發(fā)明專利]一種酶標(biāo)記仿生免疫分析檢測(cè)敵百蟲(chóng)和乙酰甲胺磷的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410669510.8
• 申請(qǐng)日: 2014-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104330552A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐志祥;時(shí)辰;高繪菊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/535
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶標(biāo)記仿生免疫分析檢測(cè)敵百蟲(chóng)和乙酰甲胺磷的方法，屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種敵百蟲(chóng)和乙酰甲胺磷等有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的快速、靈敏檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

有機(jī)磷農(nóng)藥是一類作用于農(nóng)作物用以殺滅以及防止病蟲(chóng)害的有機(jī)化合物殺蟲(chóng)劑。經(jīng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，其通過(guò)消化道、呼吸道等途徑進(jìn)入人畜體內(nèi)后會(huì)造成神經(jīng)疾病，具有神經(jīng)毒性。部分有機(jī)磷農(nóng)藥經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化會(huì)形成新物質(zhì)，如敵百蟲(chóng)經(jīng)轉(zhuǎn)化后成為敵敵畏，毒性增強(qiáng)，對(duì)環(huán)境及動(dòng)物造成更大危害。

目前為止，傳統(tǒng)的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫分析法等對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。常規(guī)大型儀器及設(shè)備具有使用地域局限性，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，分析過(guò)程繁瑣等缺點(diǎn)，很難適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及批量樣品的快速測(cè)定。酶聯(lián)免疫法雖然具有較高靈敏度和較低檢出限，但其抗體制備困難且不易保存容易失活。因此將有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原4-(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸分子印跡聚合物作為公共模板合成仿生抗體，建立酶標(biāo)記仿生免疫吸附分析技術(shù)用于有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測(cè)，具有成本低，制備周期短，不易失活，容易保存等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于保障蔬菜產(chǎn)品安全具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器價(jià)格昂貴、特異性抗體難制備、農(nóng)藥檢測(cè)種類單一等缺陷，提供一種酶標(biāo)記仿生免疫分析檢測(cè)敵百蟲(chóng)和乙酰甲胺磷的方法。

一種酶標(biāo)記仿生免疫分析檢測(cè)敵百蟲(chóng)和乙酰甲胺磷的方法，包括以下步驟：

1.有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原的合成：冰浴條件下將0.005-0.02mol?4-氨基丁酸溶于5-10mL?2.5mol/L氫氧化鈉溶液中，完全溶解后向上述溶液中滴加1.215mL?O，O'-二甲基硫代磷酰氯，室溫下磁力攪拌器攪拌6h。洗滌去除雜質(zhì)，并用濃度為1.0mol/L鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值至2.0。10-20mL乙酸乙酯萃取三次后向有機(jī)相加入無(wú)水硫酸鈉過(guò)夜干燥，旋蒸得有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原(4-(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸)。

2.酶標(biāo)抗原的制備：將步驟1)制備的有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原0.03-0.05mmol溶于600-800μL二甲基亞砜中，然后加入3.4mg?N-羥基琥珀酰亞胺和12.4mg?N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-4h，離心取上清液，得到溶液A。將5-10mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于1-2mL濃度50mmol/L?K₂HPO₄溶液中作為溶液B。冰浴條件下，將50-200μL溶液A緩慢逐滴加入溶液B中，邊滴加邊搖動(dòng)。4℃反應(yīng)8-12h，取出后用磷酸鹽緩沖溶液PBS透析1-3天，收集透析液得到酶標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述5倍PBS溶液組分為：由Na₂HPO₄·12H₂O：68.80g、NaH₂PO₄·2H₂O：8.97g和NaCl：45.00g，加雙蒸水定容至1L組成；將5倍PBS用雙蒸水稀釋5倍即為PBS溶液。

3.多識(shí)別位點(diǎn)水相分子印跡膜的制備：4-8mL超純水、3-6mL二甲基亞砜和8-15mL乙腈的混合溶劑體系中分別加入摩爾比1:3:4-6所述的有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原、甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯，然后加入10-20mg偶氮二異丁腈，攪拌反應(yīng)0.5-2h。96孔酶標(biāo)板上每孔加入200μL上述混合液，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下20-60℃聚合反應(yīng)12-24h，用體積比3-9:1甲醇/冰乙酸溶液超聲洗脫4-10h后用濃度100％甲醇溶液洗脫2-4h，干燥后得多識(shí)別位點(diǎn)水相印跡聚合物膜。

4.多殘留酶標(biāo)記仿生免疫分析方法的建立：步驟3)制備的水相印跡聚合物膜作為仿生抗體；步驟2)制備的酶標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS溶液稀釋5000倍，作為酶標(biāo)稀釋液。

將96孔酶標(biāo)板第1行設(shè)為空白組，每孔只加200μL?PBS溶液；第2行設(shè)為對(duì)照組，每孔加100μL酶標(biāo)稀釋液和100μLPBS溶液；第3-8行每孔依次分別加入敵百蟲(chóng)或乙酰甲胺磷標(biāo)樣梯度稀釋液和100μL酶標(biāo)稀釋液。室溫孵育1h后用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗板五次。96孔酶標(biāo)板每孔加入100-200μL底物液，室溫下反應(yīng)30-60min。每孔加入50-100μL?1.25mol/L硫酸，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板第1-8行吸光度值A(chǔ)，分別計(jì)算抑制率；