[發明專利]一種小反芻獸疫轉基因植物疫苗高效表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201410669120.0
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498527A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 楊國鋒;蘇昆龍;宋智斌;王薇;王惠;孫娟;武海杰;譚子恒;李永臻;王芳
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

技術領域

本發明涉及一種基因工程技術領域中的重組載體構建，特別涉及一種重組的用于預防小反芻獸疫的植物高效表達載體的構建。

背景技術

小反芻獸疫(Peste?des?petits?rμminants，PPR)是一種由小反芻獸疫病毒(Peste?des?Petits?Rμminants?virμs,PPRV)引起的急性、接觸性疫病，主要感染以山羊和綿羊等小反芻動物。該疫病的發病率和死亡率可高達100％和50％。對于該疫病目前尚無有效的治療方法，因此要尋找有效的預防方法對該疫病進行預防。隨著生物技術和基因工程技術的發展，對PPRV的研究也更為深入。PPRV基因組為單股負鏈RNA，從RNA鏈的3′端至5′端依次排列著N-P-M-F-H-L?6個基因，分別編碼相應的6種結構蛋白。其中，F蛋白是組成病毒囊膜表面的一種纖突，屬于融合蛋白，在病毒誘導的細胞病理學方面發揮著重要作用，是決定病毒感染成功與否的關鍵因素。Devireddy等發現純PPRV的F蛋白具有生物學活性并且容易引起病毒引導性溶血，細胞融合和開始感染，具有免疫原性，這是本發明采用F蛋白基因作為目的基因的重要依據。

轉基因植物可食疫苗利用分子生物學技術，將病原微生物的抗原編碼基因轉入植物，并在植物中表達出活性蛋白，人或動物食用含有該種抗原的轉基因植物，會激發腸道免疫系統，從而產生對病毒、寄生蟲等病原菌的免疫能力。

發明內容

本發明的目的在于：通過基因重組的方法將將F基因與植物表達載體pBI121連接，并且在其兩側加入調控序列使其能在植物中高效的表達。最終實現預防小反芻獸疫的目的。

本發明提供一種植物表達載體，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和該基因連接的重組質粒，共計五種，分別為：

pBI121-F，

121-C-F-M12-M34

121-C-FKDEL-M12-M34

121-C-G-F-M12-M34

121-C-G-FKDEL-M12-M34

其基因序列見序列表。

其中的F蛋白基因見序列表1。

本發明通過對pBI121植物表達載體的HindⅢ酶切位點到EcoR?Ⅰ酶切位點處進行改造得到的,改造所需的基因或調控序列包括GFP、MAR12、MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其對應的基因序列見序列表2-7。

本發明添加相關基因及序列后共改造4條載體，其添加的基因和調控序列依次排列順序為：

MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34；

MAR12-CsVMV-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34。

本發明還提供本發明的植物表達載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，用引物提取相關質粒并進行PCR擴增，

步驟2，對PCR產物使用T/A克隆的方法連接到pUCM-T載體上，

步驟3，植物表達載體的構建。

優選的，所述方法，步驟如下：

步驟1、基因擴增，

MAR序列：以pMD-MAR質粒為模板，分別使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、MAR34-R進行克隆；

GFP序列：以pHL005為模板，以GFP-F、GFP-R為模板；

PPRV-F、F-KDEL序列:以PPRV-F為模板，分別以PPRV-F-F、PPRV-F-R和PPRV-F-F、PPRV-FKDEL-R為模板；

CsVMV序列：以合成的CsVMV為模板，以CsVMV-F、CsVMV-R為模板；

步驟2，將步驟1所得基因連接到pUCM-T載體上，所得質粒命名為：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL。

步驟3，植物表達載體的構建：

1)、表達載體pBI121-CsVMV的構建

2)、表達載體pBI121-CsVMV-GFP的構建

3)、表達載體pBI121-CsVMV-GFP-Mar12的構建

4)、中間表達載體pUCM-GUS-GFP的構建

5)、中間表達載體的pUCM-GUS-GFP-MAR34的構建