[發(fā)明專利]一種小反芻獸疫轉(zhuǎn)基因植物疫苗高效表達(dá)載體的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410669120.0
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498527A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊國鋒;蘇昆龍;宋智斌;王薇;王惠;孫娟;武海杰;譚子恒;李永臻;王芳
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

1.一種植物表達(dá)載體，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和該基因連接的重組質(zhì)粒，共計五種，分別為：

pBI121-F，

121-C-F-M12-M34

121-C-FKDEL-M12-M34

121-C-G-F-M12-M34

121-C-G-FKDEL-M12-M34

其基因序列見序列表。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的F蛋白基因見序列表1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，通過對pBI121植物表達(dá)載體的HindⅢ酶切位點到EcoRⅠ酶切位點處進(jìn)行改造得到的,改造所需的基因或調(diào)控序列包括GFP、MAR12、MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其對應(yīng)的基因序列見序列表。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其中，添加相關(guān)基因及序列后共改造4條載體，其添加的基因和調(diào)控序列依次排列順序為：

MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34；

MAR12-CsVMV-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34。

5.權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，用引物提取相關(guān)質(zhì)粒并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

步驟2，對PCR產(chǎn)物使用T/A克隆的方法連接到pUCM-T載體上，

步驟3，植物表達(dá)載體的構(gòu)建。

6.權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1、基因擴(kuò)增，

MAR序列：以pMD-MAR質(zhì)粒為模板，分別使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、MAR34-R進(jìn)行克隆；

GFP序列：以pHL005為模板，以GFP-F、GFP-R為模板；

PPRV-F、F-KDEL序列:以PPRV-F為模板，分別以PPRV-F-F、PPRV-F-R和PPRV-F-F、PPRV-FKDEL-R為模板；

CsVMV序列：以合成的CsVMV為模板，以CsVMV-F、CsVMV-R為模板；

步驟2，將步驟1所得基因連接到pUCM-T載體上，

所得質(zhì)粒命名為：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL，

步驟3，植物表達(dá)載體的構(gòu)建：

1)、表達(dá)載體pBI121-CsVMV的構(gòu)建

2)、表達(dá)載體pBI121-CsVMV-GFP的構(gòu)建

3)、表達(dá)載體pBI121-CsVMV-GFP-Mar12的構(gòu)建

4)、中間表達(dá)載體pUCM-GUS-GFP的構(gòu)建

5)、中間表達(dá)載體的pUCM-GUS-GFP-MAR34的構(gòu)建

6)、中間表達(dá)載體pUCM-F-GFP-MAR34和pUCM-FKDEL-GFP-MAR34的構(gòu)建

7)、植物表達(dá)載體pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和

pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34構(gòu)建

8)、植物表達(dá)載體pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和

pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34構(gòu)建

9)、植物表達(dá)載體pBI121-F的構(gòu)建

向載體上連接上一個組件后就使用PCR驗證的方法進(jìn)行驗證，驗證所使用的引物一條pBI121載體上的一段序列一條為所連入的組件上的一段序列。