[發(fā)明專利]牛輪狀病毒VP8*亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410668656.0
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104479028A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聞曉波;朱光怡;冉旭華;苗艷;張峣;曹思;倪宏波;朱戰(zhàn)波
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/15;A61P31/14
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及牛輪狀病毒VP8*亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

輪狀病毒為呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，是導(dǎo)致多種新生動物和嬰幼兒胃腸炎的主要病原體。牛輪狀病毒腹瀉以精神沉郁、厭食、腹瀉、脫水為主要特征，7日齡以內(nèi)犢牛最易感染，發(fā)病率可高達(dá)90％～100％，死亡率可達(dá)10％～50％。如果繼發(fā)大腸桿菌性敗血癥則可導(dǎo)致死亡率進一步上升，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟效益。

輪狀病毒粒子由3層衣殼組成，最外層衣殼由VP7和纖突蛋白VP4組成，兩者均可以獨立地誘導(dǎo)中和抗體。研究表明，VP4蛋白具有諸多功能，如病毒血凝素、吸附和細(xì)胞侵入、毒力相關(guān)。VP4蛋白經(jīng)胰酶裂解為VP8*(28kDa、aa?1～240)和VP5*(60kDa、aa?247-775)兩種亞單位，其中VP8*具有VP4蛋白的主要抗原表位，且決定VP4蛋白血清特異性中和反應(yīng)。

目前尚無特效藥物治療輪狀病毒性胃腸炎，疫苗接種是預(yù)防該病的主要措施。輪狀病毒的免疫防制主要通過免疫懷孕母牛，新生犢牛通過初乳獲得天然被動免疫。一直以來廣泛應(yīng)用滅活疫苗來進行輪狀病毒的免疫防制，但滅活疫苗不總是安全的，經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)。而且牛源輪狀病毒在猴源MA104細(xì)胞系上擴增效率較低，病毒滴度較低，一般只能達(dá)到10⁴～10⁵cfu/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到滅活疫苗的所要求的病毒滴度，必須要經(jīng)過培養(yǎng)后的濃縮和純化，導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。所以世界范圍內(nèi)不同研究小組嘗試DNA疫苗、病毒樣顆粒疫苗、植物可食用疫苗。但是這些疫苗存在制備工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等缺點，不適合商品化疫苗生產(chǎn)，目前只停留在實驗室研究階段。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所于力課題組將綿羊輪狀病毒LLR-85毒株(G10P[15])VP7基因替換為牛源G6型VP7基因進而開發(fā)出牛輪狀病毒重配弱毒候選疫苗，但是任何輪狀病毒活疫苗都存在排毒的問題。更重要的是，活疫苗不能用于懷孕母牛免疫。因此亟待研發(fā)安全、高效的新型牛輪狀病毒疫苗用來防制牛輪狀病毒性腹瀉。

近年來，表位疫苗的使用越來越廣泛，它是利用基因工程的手段，體外表達(dá)或人工合成病原微生物的表位，將其作為一種疫苗使用。表位疫苗相對于傳統(tǒng)疫苗來說最大的優(yōu)勢就是可以克服傳統(tǒng)疫苗散毒風(fēng)險以及活疫苗不能用于懷孕動物等缺陷。已在人Wa株輪狀病毒VP8*上鑒定出5個抗原表位，其中3個為線性中和表位(aa?1-10、aa55-66和aa?223-234)，且aa?1-10表位在多種毒株間高度保守，對研制抗多種毒株或血清型的輪狀病毒疫苗有重要意義。

輪狀病毒基因型別組合眾多，不同基因型間的交叉免疫甚少，這給疫苗研制帶來了困難。但是，研究發(fā)現(xiàn)一個P基因型可能覆蓋數(shù)個G基因型，即某個P型可以與不同的G型組合，理論上同一P型可以誘導(dǎo)抗不同G型的異型免疫。而決定P型的VP4蛋白含有多個線性化抗原表位，且該蛋白無需翻譯后修飾，其經(jīng)胰酶裂解后形成的VP8*片段，包含了VP4型特異性主要抗原表位，皆為線性且較為保守，提示可以利用VP8*蛋白來開發(fā)新型PRV亞單位疫苗。

世界范圍內(nèi)流行的牛輪狀病毒G基因型主要為G6和G10兩種，其P基因型主要為P[5]和P[11]，除此之外還存在P[1]、P[21]和P[29]。常規(guī)的疫苗開發(fā)主要是開發(fā)二價疫苗同時防治G6P[5]和G10P[11]輪狀病毒毒株，這給疫苗開發(fā)和生產(chǎn)帶來一定的困難，注定導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)成本提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型的牛輪狀病毒VP8*亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的牛輪狀病毒VP8*亞單位重組嵌合蛋白，其是由破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2以及基因型為G6P[5]的牛輪狀病毒VP8*亞單位的截短形式a和截短形式b嵌合而成的重組蛋白；其中，截短形式a和截短形式b之間無多余氨基酸，且為多拷貝，在破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、多拷貝的基因型為G6P[5]的牛輪狀病毒VP8*亞單位的截短形式a和截短形式b之間通過柔性Linker連接。

其中，所述破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、基因型為G6P[5]的牛輪狀病毒VP8*亞單位的截短形式a和截短形式b的氨基酸序列分別如SEQ?ID?No.1-3所示。

本發(fā)明還提供編碼上述重組嵌合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示。