[發明專利]一種發酵生產L-亮氨酸的方法

在審

• 申請號: 201410666558.3
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104404095A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 劉帥;李靜;宋朋睿
• 申請（專利權）人: 河南巨龍生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12R1/13
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 時國珍

技術領域

????本發明屬于氨基酸生產技術領域，主要涉及一種發酵生產L-亮氨酸的方法。

背景技術

L-亮氨酸，又稱白氨酸，1819年Proust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到結晶，并定名為亮氨酸。L-亮氨酸是常見十八種氨基酸中的一種，也是人體必需氨基酸之一，亮氨酸可作為營養增補劑、調味增香劑。可配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑，降血糖劑，植物生長促進劑。L-亮氨酸的生產方法主要有提取法、化學合成法、酶催化法、微生物發酵法等。我國大部分廠家采用蛋白質水解法生產L-亮氨酸，但水解法生產L-亮氨酸費時、污染嚴重、收率低、產品質量得不到保證，大規模生產受到限制。化學合成法得到的亮氨酸是消旋的DL-亮氨酸，為了得到L-亮氨酸，必須進行光學異構體的拆分，因此化學合成法很少用于L-亮氨酸的生產。酶法生產L-亮氨酸中所用到的酶需通過微生物發酵生成并提取精制，工藝過程比較復雜，且成本較高，因此目前尚未得到廣泛的應用。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種發酵生產L-亮氨酸的方法，通過對發酵過程殘糖濃度控制、溫度控制、pH與溶解氧分段控制及培養基的基本組成進行調整，使發酵周期縮短，發酵產量提高，工藝簡單易控制，成本較低，非常適合大規模工業應用。

本發明實現上述目的采用的技術方案是：一種發酵生產L-亮氨酸的方法，包括以下步驟：

在搖瓶中裝入LB培養基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為110r/min，溫度為31℃條件下，培養28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發酵培養基的發酵罐中，并在溫度為31-32℃條件下進行發酵培養；

發酵過程中，通過控制攪拌轉速和風量，使發酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L；通過自動流加氨水控制發酵過程的pH，在菌體OD值達到25之前控制pH為6.4-6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；所述菌體OD值為測定樣品稀釋20倍后測定的OD’值與稀釋倍數的乘積；發酵結束后提取和精制L-亮氨酸。

所述的發酵培養基中包括以下質量百分數的含碳化合物和含氮化合物：無水葡萄糖0-3%、玉米漿3-6%、硫酸銨1-1.5%、醋酸銨0.7-1.0%、磷酸二氫鉀0.05-0.1%、硫酸鎂0.2-0.3%、蛋氨酸?0.04%、異亮氨酸?0.006%和谷氨酸?0.07%；

所述的發酵培養基中微量元素和維生素的添加量為VB₁?300ug/L、VH50?ug/L、FeSO₄?0.02-0.05mg/L、MnSO₄?0.01-0.03mg/L和ZnSO₄?0.02-0.05mg/L.

發酵過程中控制殘糖的質量百分數為0.005-0.05%。

所述的發酵培養基中，外加其重量0.3%的消泡劑。

本發明的有益效果

本發明提供的發酵生產L-亮氨酸的方法，通過對發酵過程殘糖濃度控制、溫度控制、pH與溶解氧分段控制及培養基的基本組成進行調整，使發酵周期縮短，發酵產量提高，工藝簡單易控制，成本較低，非常適合大規模工業應用。尤其重量的是，pH與溶解氧分段控制，目的是為了縮短菌種的發酵時間、增加產量。通過發酵過程控制優化，菌體生長健壯，在10噸發酵罐內試驗，發酵周期由原來的50小時縮短至35小時，產酸單位由原來的30g/L增加到38g/L，效果十分顯著。

具體實施方式

一種發酵生產L-亮氨酸的方法，包括以下步驟：

在搖瓶中裝入LB培養基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為110r/min，溫度為31℃條件下，培養28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發酵培養基的發酵罐中，10%接種量指種子液的體積為接種后發酵培養液總體積的10%，并在溫度為31-32℃條件下進行發酵培養；

發酵過程中，通過控制攪拌轉速和風量，使發酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L；通過自動流加氨水控制發酵過程的pH，在菌體OD值達到25之前控制pH為6.4-6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；發酵結束后提取和精制L-亮氨酸。