[發明專利]一種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201410660228.3
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104404144A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 胡雙芳;肖性龍;李蓉;余以剛;吳暉
• 申請（專利權）人: 華南理工大學;中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，特別涉及一種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用。

背景技術

食物的微生物污染是影響食品安全的重要因素之一，在其貯藏與加工過程中，快速、準確地檢測食物微生物污染，是控制和保障食品安全的重要手段。目前，對于食品中大腸菌群的檢測，國內多數采用的檢測方法是依據中華人民共和國國家標準《食品衛生微生物學檢驗-大腸菌群的快速檢測》(GB/T4789.32-2002)。國標法檢測結果的準確性、靈敏性均較高，但是操作繁雜、耗時較長，不適合于保質期短的食品檢測；盡管快速檢測國標法大大縮短了試驗周期，操作也相對較易，但仍然需要使用大量玻璃容器和儀器，不便于現場操作。進出口行業標準《食品中大腸菌群和大腸桿菌快速計數法PetrifilmTM測試片法》(SN/T?1896-2007)中的3M試紙快速檢測方法由于前處理簡單，處理時間短，在生產加工企業的現場檢測中具有較大優勢，但是其檢測效果和檢測限量是否達到國家規定的食品衛生標準還有待證實，且造價成本較高，不適應于日常生產生活中大批量的食品抽檢。

由于大腸菌群的廣泛存在，使得傳統檢測方法變得繁復且低效，不適應于現代食品檢測中快速靈敏的要求。因此研究出一種能夠同時檢測食品中各種大腸菌群且快速簡潔的通用型檢測方法迫在眉睫。

目前國內外應用于檢測大腸菌群的分子生物學技術，主要分為三類：普通PCR技術、熒光PCR技術和基因芯片技術。基因芯片方法檢測效率高，但技術還不成熟，假陽性率和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術成熟，但是，由于檢測樣品中，微生物種類很多，引物設計是難點，引物特異性不高，容易造成假陽性結果；而且只能定性檢測出大腸菌群，而不能定量；再者需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染。熒光PCR是在普通PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術，其除了具有普通PCR的優點外，還具有以下優點：(1)特異性更強，靈敏度更高：由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，從而提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度；(2)全封閉反應，在線式實時監測熒光，無須PCR的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠；(3)可實現單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監控抽提效率及排除抑制劑干擾；(4)不接觸有毒試劑，操作安全；(5)有利于規?；⒆詣踊奥摼W管理；(6)適用范圍更廣，理論上可檢測任何大腸菌群的核酸。但是，熒光定量PCR對引物的要求相對于普通PCR而言，更為苛刻。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于檢測大腸菌群的試劑盒。該試劑盒能定量檢測大腸菌群。

本發明的另一目的在于提供所述試劑盒的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種用于檢測大腸菌群的試劑盒，包括引物序列和探針序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264組成；探針序列為探針Pb1156A；

所述的上游引物F1130a的序列為如下所述的任一條序列：核心序列A；或以核心序列A為中心，向5’和3’端分別或同時延伸1～10個核苷酸得到的序列；優選為核心序列A、向核心序列A的5’端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序列A的3’端延伸10個核苷酸得到的序列；

核心序列A：5’-TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3’；

所述的上游引物F1130b的序列為如下所述的任一條序列：核心序列B；或以核心序列B為中心，向5’和3’端分別或同時延伸1～10個核苷酸得到的序列；優選為核心序列B、向核心序列B的5’端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序列B的3’端延伸10個核苷酸得到的序列；

核心序列B：5’-ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3’；

所述的下游引物R1264的序列為如下所述的任一條序列：核心序列C；或以核心序列C為中心，分別或同時向5’端延伸1～10個核苷酸以及向3’端延伸1～2個核苷酸得到的序列；優選為核心序列C、向核心序列C的5’端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序列C的3’端延伸2個核苷酸得到的序列；

核心序列C：5’-CCATGCCGTGGGTTTCAATAT-3’；