[發明專利]一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態發酵方法

在審

• 申請號: 201410660108.3
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104388347A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李衛娟;王計偉;王宇霄
• 申請（專利權）人: 安佑生物科技集團股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及飼用微生物發酵工程技術領域，特別涉及一種高芽孢率高抗逆性的飼用枯草芽孢桿菌固態發酵方法。

背景技術

抗生素在中國具有較高的使用率，其中一半主要應用于醫藥行業，另一半則應用于養殖業。自20世紀50年代人們發現飼料中添加低濃度的抗生素可以預防動物細菌性疾病的發生并可促進動物生長后，抗生素的應用日益泛濫，繼而導致了諸多食品安全及生物安全問題，如藥物殘留、耐藥細菌產生等。

鑒于抗生素濫用引發的一系列問題，人們逐漸將目光轉移至微生態制劑。我國動物微生態制劑的研究起步相對較晚，但發展較快。目前國內已有一些科研單位、企業研發并生產出相關飼用微生物，并應用于動物養殖中。

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)是一種產芽孢的G⁺細菌，其菌體生長過程中產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，對致病菌或內源性感染的條件性致病菌有明顯的抑制作用；能夠迅速消耗環境中的游離氧，造成腸道低氧，促進厭氧菌的生長，繼而降低腸道pH值，抑制病原微生物的生長；另外枯草芽孢桿菌能夠合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內干擾素和巨噬細胞的活性。我國農業部將其列為免做安全鑒定的一級菌種。枯草芽孢桿菌在一定條件下，會生成芽孢。以芽孢狀態存在的菌體，具有極強的抗逆性，如耐高溫、耐酸堿、耐擠壓。芽孢形態能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，有利于儲存，同時有利于菌劑通過動物胃部苛刻的強酸環境，在腸道內發揮自身益生功效。

國內目前對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在菌種的篩選、抑菌效果和成分分析中，缺乏對枯草芽孢桿菌實際工業生產方面的相關技術指導和技術積累。現有的培養方法發酵枯草芽孢桿菌，芽孢率在80％左右，發酵完畢之后需要烘干或風干，生產效果也不盡理想，如何在保證有效菌數的同時，盡可能提高芽孢率，同時兼顧生產成本，成為困擾枯草芽孢桿菌實際工業生產的瓶頸問題。

發明內容

本發明提供了一種高芽孢率高抗逆性的飼用枯草芽孢桿菌固態發酵方法，能夠有效解決目前枯草芽孢桿菌菌劑制備過程中芽孢不足的問題，使其具有極好的耐酸、耐膽鹽及耐高溫性能，能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，同時有利于菌劑通過動物胃部苛刻的強酸環境，在腸道內部發揮有利作用。

為了解決上述問題，本發明提供一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態發酵方法。具體步驟是：

(1)菌株：選用枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?CICC?10453；

(2)種子培養：將步驟(1)所述菌株，在營養瓊脂培養基上活化培養；之后在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養肉湯培養基中振蕩培養獲得一級種子液；將所述一級種子液接種于營養肉湯培養基中擴大培養得到二級種子液；

(3)固態發酵培養：將所述二級種子液與營養鹽溶液共同接種于固態培養基中，充分混合后將其平鋪于淺盤中發酵，發酵完畢直接收集，粉碎過40目篩，即得枯草芽孢桿菌固態發酵成品。

其中，所述枯草芽孢桿菌是Bacillus?subtilis?CICC?10453，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

其中，所述步驟(2)中營養瓊脂培養基，組成為牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％，瓊脂2.0％，蒸餾水配制，pH?7.2～7.4。

其中，營養肉湯培養基，組成為牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％，蒸餾水配制，pH?7.2～7.4。

其中，所述步驟(2)中營養瓊脂培養基活化培養條件為37℃倒置培養16～24h；一級種子培養條件為37℃，160～180rpm振蕩培養4～8h；二級種子培養條件為接種量1～5％，37℃，160～180rpm振蕩培養3～6h。

其中，所述步驟(2)中一級種子液的濃度為1×10⁹CFU/mL；二級種子液的濃度為2×10⁹CFU/mL。

其中，所述步驟(3)中固態培養基制備方法：以質量計，70～90％麥麩，10～30％稻殼，121℃滅菌30min。

其中，所述步驟(3)中營養鹽溶液的配制：0.5～1.0％葡萄糖、0.5～1.0％蛋白胨、0.2～0.8％硫酸銨、0.5～1.5％磷酸二氫鉀、0.01～0.04％硫酸錳，自來水配制，調節pH值至6～8，115℃滅菌20min。

其中，所述步驟(3)中二級種子液、營養鹽與固態培養基質量比為0.05～0.2：0.4～0.7：1。