[發(fā)明專利]一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410660108.3
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104388347A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李衛(wèi)娟;王計(jì)偉;王宇霄
• 申請（專利權(quán)）人: 安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州華博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

1.一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，具體步驟是：

(1)菌株：選用枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?CICC10453；

(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)所述菌株，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)獲得一級種子液；將所述一級種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)得到二級種子液；

(3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：將所述二級種子液與營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，充分混合后將其平鋪于淺盤中發(fā)酵，發(fā)酵完畢直接收集，粉碎過40目篩，即得枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％，瓊脂2.0％，蒸餾水配制，pH7.2～7.4；

所述步驟(2)中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％，蒸餾水配制，pH7.2～7.4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化培養(yǎng)條件為37℃倒置培養(yǎng)16～24h；一級種子培養(yǎng)條件為37℃，160～180rpm振蕩培養(yǎng)4～8h；二級種子培養(yǎng)條件為接種量1～5％，37℃，160～180rpm振蕩培養(yǎng)3～6h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中一級種子液的濃度為1×10⁹CFU/mL；二級種子液的濃度為2×10⁹CFU/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中固態(tài)培養(yǎng)基制備方法：以質(zhì)量計(jì)，70～90％麥麩，10～30％稻殼，121℃滅菌30min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中營養(yǎng)鹽溶液的配制：0.5～1.0％葡萄糖、0.5～1.0％蛋白胨、0.2～0.8％硫酸銨、0.5～1.5％磷酸二氫鉀、0.01～0.04％硫酸錳，自來水配制，調(diào)節(jié)pH值至6～8，115℃滅菌20min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中，二級種子液、營養(yǎng)鹽與固態(tài)培養(yǎng)基的質(zhì)量比為0.05～0.2∶0.4～0.7∶1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中淺盤發(fā)酵高度為2cm～4cm。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中發(fā)酵分為兩個(gè)階段，菌體生長階段與芽孢生成階段；菌體生長階段培養(yǎng)條件為：32～37℃發(fā)酵24～36h；芽孢生成階段培養(yǎng)條件為：37～40℃發(fā)酵12～24h。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～9任一所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在，步驟(3)中枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品水分不高于14％。