[發(fā)明專利]一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410659965.1
• 申請(qǐng)日: 2014-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104474542A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂茂杰;梁武;楊保收;李亞杰;邊程
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61K39/135;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 楊慧玲

1.一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，確保病毒效價(jià)≥10^7.0TCID₅₀/ml，收獲細(xì)胞毒液；

2)將步驟1)得到的細(xì)胞毒液，利用中空纖維濾柱進(jìn)行澄清濃縮處理；

3)將步驟2)濃縮處理后的病毒在攪拌狀態(tài)下按0.1～0.3％(v/v)的比例加入β-丙內(nèi)酯滅活，得到第一抗原原液；

4)取pET28a-FMDV?VP1菌株進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，而后向培養(yǎng)體系中加入0.1～1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4～6h，誘導(dǎo)溫度為25～37℃，而后收集菌體，破壁，收集包涵體；

5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15～25mg/mL的濃度重懸步驟4)得到的包涵體，收集上清液，再用Ni²⁺柱純化蛋白，復(fù)性蛋白，再過(guò)濾除菌，即得到第二抗原原液；

6)將步驟3)得到的第一抗原原液與步驟5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到混合抗原原液，上述按比例是確保得到的混合抗原原液中PCV2含量為10^7.0TCID50/頭份、FMDV?VP1蛋白含量為80μg/頭份或PCV2蛋白含量為10^7.5TCID50/頭份、FMDV?VP1蛋白含量為100μg/頭份；

7)將步驟6)得到的混合抗原原液與疫苗佐劑攪拌混勻，即得到一種二聯(lián)滅活疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟1)的具體流程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染復(fù)數(shù)為0.005～0.02接種于PK-15細(xì)胞，34～39℃吸附25～35min，加入含2～5％犢牛血清和0.5～2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，34～39℃培養(yǎng)，而后反復(fù)凍融，確保病毒效價(jià)≥10^7.0TCID₅₀/ml，收獲病毒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟7)混合抗原原液與疫苗佐劑的混合比例為1:1(v/v)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟2)濾柱澄清處理之前先利用菲托濾板進(jìn)行一步過(guò)濾處理。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟3)滅活條件為：加入β-丙內(nèi)酯后置于4℃條件下攪拌滅活48～72h，然后置于37℃水浴2h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述的擴(kuò)增培養(yǎng)具體包括以下流程：取pET28a-FMDV?VP1菌株劃線至Kan+抗性培養(yǎng)板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接入10mL含有Kan+的液體LB培養(yǎng)基中，37℃220r/min振蕩培養(yǎng)11-16h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述的破壁具體包括以下流程：用1/10菌液體積的PBS緩沖液重懸菌體，加100μg/mL溶菌酶，于冰上超聲破碎菌體。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)具體包括以下流程：IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為5h，誘導(dǎo)溫度為，37℃。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟5)所述的Ni²⁺柱為Ni-NTA柱。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟5)所述的復(fù)性方法為：稀釋復(fù)性結(jié)合超濾濃縮。