[發明專利]一種二聯滅活疫苗制備方法

在審

• 申請號: 201410659965.1
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104474542A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 呂茂杰;梁武;楊保收;李亞杰;邊程
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K39/135;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 楊慧玲

技術領域

本發明涉及疫苗技術領域，具體涉及一種二聯滅活疫苗制備方法。

背景技術

口蹄疫(foot-and-mouth?disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth?disease?virus,FMDV)感染引起的一種急性和高度接觸性的動物傳染病。FMDV感染對象為牛、羊、豬等家養以及野生的偶蹄動物。流行病學調查和感染實驗證明，約有100多種動物可感染此病毒。該病的臨床特征是傳播速度塊、流行范圍廣，成年動物的口腔黏膜、蹄部和乳房等處發生水泡和潰爛，幼齡動物多因心肌受損導致較高的死亡率。除動物死亡造成直接經濟損失外，動物在患病期間肉和奶的生產停止，哺乳期產奶量降低，耐過動物生長緩慢，種用價值喪失，也可造成嚴重的經濟損失。本病分布于世界各地，在亞洲、非洲、南美洲和中東等地區廣泛流行，而已消滅口蹄疫的國家和地區常有重新爆發本病的例證。鑒于口蹄疫對世界經濟發展、生態和諧及社會安全等方面危害極大，國際獸醫局(OIE)和聯合國糧農組織(FAO)將其列為必須通報的疫病之一，我國也將其列為一類動物傳染病的第一位。

豬圓環病毒(Porcine?circovirus，PCV)是迄今發現的一種最小的動物病毒。現已知PCV有兩個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，而PCV2為致病性的病毒，PCV2除導致仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning?Multisystemic?Wasting?Syndrome，PMWS)外，還能導致母豬的繁殖障礙，PCVD廣泛存在于世界各地的豬群中，造成很大的經濟損失。

近年來，我國豬群中PCV2和豬O型FMDV流行十分嚴重，發病率和死亡率也不斷提高，給養豬業造成巨大經濟損失。當前對這2種病毒性疫病的防控主要采用滅活疫苗，但PCV2滅活疫苗存在病毒難培養的現實，FMDV滅活疫苗存在因滅活不徹底而散毒的危險。研究表明，利用生物反應器培養的PCV2病毒可提高病毒滴度和重組蛋白研制的亞單位疫苗對FMDV感染具有良好的免疫效果，FMDV的結構蛋白Vp1包含FMDV的主要抗原位點，是病毒的主要免疫保護性抗原，能誘導動物機體產生保護性中和抗體，可用于FMDV亞單位疫苗的研制。因此，研制同時預防這兩種病毒性疫病的二聯疫苗具有重要意義。急需FMDV和PCV2的二聯滅活疫苗，以同時預防O型口蹄疫和PCV2引起的PMWS綜合癥。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種二聯滅活疫苗制備方法，該方法采用原核表達系統表達純化FMDV-Vp1蛋白，結合現有PCV-2全病毒滅活疫苗生物反應器懸浮培養的高滴度病毒，制備出豬O型口蹄疫VP1亞單位、PCV-2二聯滅活疫苗。

為了實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種二聯滅活疫苗制備方法，包括以下步驟：

1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主細胞進行病毒擴增，確保病毒效價≥10^7.0TCID₅₀/ml，收獲細胞毒液；

2)將步驟1)得到的細胞毒液，利用中空纖維濾柱進行澄清濃縮處理；

3)將步驟2)濃縮處理后的病毒在攪拌狀態下按0.1～0.3％(v/v)的比例加入β-丙內酯滅活，得到第一抗原原液；

4)取pET28a-FMDV?VP1菌株進行培養擴增，而后向培養體系中加入0.1～1mmol/L的IPTG進行誘導，誘導時間為4～6h，誘導溫度為25～37℃，而后收集菌體，破壁，收集包涵體；

5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15～25mg/mL的濃度重懸步驟4)得到的包涵體，收集上清液，再用Ni²⁺柱純化蛋白，復性蛋白，再過濾除菌，即得到第二抗原原液；

6)將步驟3)得到的第一抗原原液與步驟5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到混合抗原原液，上述按比例是確保得到的混合抗原原液中PCV2含量為10^7.0TCID50/頭份、FMDV?VP1蛋白含量為80μg/頭份或PCV2蛋白含量為10^7.5TCID50/頭份、FMDV?VP1蛋白含量為100μg/頭份；

7)將步驟6)得到的混合抗原原液與疫苗佐劑攪拌混勻，即得到一種二聯滅活疫苗。