[發明專利]一種豬圓環病毒2型滅活凍干疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201410659949.2
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104383527A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 唐榮宏;呂茂杰;李亞杰;楊保收;梁武
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K9/19;A61K47/42;A61P31/20
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 楊慧玲

技術領域

本發明涉及疫苗制備技術領域，具體涉及一種豬圓環病毒2型滅活凍干疫苗的制備方法。

背景技術

豬圓環病毒病是由豬圓環病毒2型(Porcine?circovirus?type2，PCV2)引起的一系列疾病，包括斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning?multisystemie?wasting?syndrome，PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine?dermatitis?and?nephrophathy?syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine?respiratory?disease?complex，PRDC)。

1997年，Clark等首次分離到豬圓環病毒2型。在2008年第20屆國際豬病大會上，圓環病毒病被列為當前危害養豬業發展的頭號疫病。我國在2000年證實豬群中存在PCV2感染，2002年由PCV2感染的引起的PWMS在全國呈暴發流行。豬圓環病毒病造成豬只生長慢，飼料報酬低，機體免疫力下降，給養豬業造成了嚴重威脅和巨大經濟損失。據調查，PCV2在我國的陽性率已經達到80％以上。

疫苗是預防該病的主要方法之一。目前，我國商品化的豬圓環病毒2型疫苗生產工藝普遍是將收獲的病毒液直接滅活，而后加入礦物油佐劑乳化而制成。這種方法由于直接以細胞繁殖的病毒液進行成品苗的生產，因此會受到細胞破碎產物、培養基成分、血清蛋白、細胞代謝產物等雜質的影響，致使疫苗免疫動物后易發生過敏反應，發熱反應等副作用，同時還會影響免疫效果，而且礦物油佐劑疫苗普遍存在注射困難，注射部位易產生腫塊。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種豬圓環病毒2型滅活凍干疫苗的制備方法，以解決其副反應率高、免疫效果差、注射困難以及不易吸收的技術問題。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種豬圓環病毒2型滅活凍干疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1)取豬圓環病毒2型病毒培養液進行澄清處理，得到病毒液；

2)對步驟1)得到的病毒液進行超濾濃縮；

3)使用分子篩層析柱對步驟2)濃縮后的病毒液進行純化；

4)利用β-丙內酯對步驟3)純化后的毒液進行滅活；

5)對步驟4)滅活后的病毒液實施凍干、制劑。

優選的，步驟1)所述澄清處理包括以下步驟：對病毒培養液先用6～10層紗布過濾，再用0.5～2μm的雙層濾膜進行過濾。

優選的，步驟2)所述濃縮的倍數為20～50倍。

優選的，步驟2)所述超濾是切向流超濾，在此基礎上可以對其所使用的濾膜孔徑優選為30～50K。

優選的，步驟3)所述分子篩層析柱所用的層析樹脂選自Sepharose?4?Fast?Flow、Sepharose?6Fast?Flow、Sepharose?CL-2B或Sepharose?CL-4B的其中一種，更優的，選擇Sepharose?6Fast?Flow樹脂。

優選的，步驟3)利用柱層析純化時，按柱體積的5～8％(v/v)上樣。

優選的，步驟3)純化后的病毒液中病毒效價≥10^8.5TCID₅₀/ml，總蛋白濃度≤300ug/mL。

優選的，步驟4)所述滅活包括以下步驟：取β-丙內酯稀釋700～900倍，將稀釋后的β-丙內酯溶液以1:(3～8)(v/v)的比例加入到步驟3)純化后的病毒液中，滅活1～3h；在此基礎上可以進一步優選為：滅活過程是在35～40℃條件下進行的。

優選的，步驟5)實施凍干時，所用凍干保護劑是由以下重量百分數的成分組成的：海藻糖1～3％；蔗糖5～8％；乳糖1～2％；聚乙烯吡咯烷酮1～5％；明膠3～6％；甘氨酸1～3％；丙氨酸0.5～1％；山梨醇1～10％；牛血清白蛋白1～2％；水余量。

制備方法可以是：

(1)按所述重量配比稱取海藻糖、蔗糖、乳糖、脫脂乳溶于少量注射用水中，高壓滅菌后備用；

(2)按所述重量配比稱取甘氨酸溶于少量注射用水中，用0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃凍存備用；

(3)將步驟(1)、(2)制得的溶液1:1混合，加注射用水至全量即得。