[發明專利]黃瓜AG-like基因CsMADS24基因過表達載體及其應用

在審

• 申請號: 201410659872.9
• 申請日: 2014-11-19
• 公開（公告）號: CN104450736A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 胡麗芳;劉世強;賀浩華;楊寅桂;蔣倫偉;王義華
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

???本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種黃瓜AG-like基因CsMADS24過表達載體及其應用。

背景技術

花的正常發育是植物賴以繁衍的基礎，也是農業生產獲得產品、提高產量的關鍵時期。通過分子生物學手段鑒定出控制花發育的基因并通過改變其表達方式，可有目的性地改變花型，產生變異的新材料可用于農作物和觀賞植物的育種應用。隨著對花發育相關問題的研究逐步的深入，發現花器官的發育是由一類MADS-box同源異形基因所控制。MADS-box基因家族得名于最先鑒定出來的四個成員的首字母：酵母的MCM1基因、擬南芥的AGAMOUS基因、金魚草的DEFICIENS基因和人的SRF基因。

?目前，調控花發育的MADS-box基因已從一系列的物種中分離克隆出來，這些物種包括擬南芥、金魚草、煙草、水稻、玉米、百合、蝴蝶蘭等。研究表明，雙子葉擬南芥花器官的發育可以歸納為花發育的ABCDE模型。該模型認為，花器官是A、B、C、D和E五類基因共同表達的結果，這五類基因基本上都為MADS-box基因。其中的C功能基因和D功能基因又稱為AG-like基因，歸屬于AG?subfamily。在模式植物擬南芥的基因組中共有4個基因：AGAMOUS（AG）、SHATTERPROOF1（SHP1）、SHP2和SEEDSTICK(STK)?屬于該家族。這四個基因有著高度的序列一致性，并表現出各自不同但又相互重疊的表達方式。其中的AG作為C功能基因在第三輪雄蕊的決定、第四輪雌蕊心皮的發育及分生組織的決定性上起作用。在AG基因的突變體ag中，第三輪的雄蕊會轉變為類似花瓣狀的結構，第四輪的心皮處會轉變為額外的小花。STK作為D類基因在胚珠的發育中起決定作用。另外的兩個基因SHP1和SHP2兼有C和D兩種功能，即在心皮和胚珠的發育中都起作用。

????在擬南芥等物種中，通過改變AG-like基因的表達方式，按人們需要設計新的花型已成為可能。利用轉基因技術抑制擬南芥AG基因的表達，其雄蕊被花瓣取代，心皮被新的花替代，形成重瓣花，為創造觀賞價值較高的重瓣花展示了美好的前景。將矮牽牛同源異型基因FBP2與35S啟動子相連，構建表達載體PBP2導入煙草，導致煙草雄蕊上產生花瓣。將英國梧桐的花器官決定基因PaAG(C類基因)轉化煙草后，花瓣的形態發生了很大變化。黃瓜作為重要的蔬菜作物，有關MADS-box基因對花發育調控的研究還相對較少。2009年黃瓜基因組測序的完成為從分子水平上研究黃瓜基因的相關功能提供了可能。通過全基因組掃描發現，僅CsMADS24可以歸屬于AG-like家族，鑒于AG-like基因在花發育中的重要作用，值得深入研究。本發明從黃瓜中克隆了1個在花瓣和雄蕊發育上發揮重要調控作用的CsMADS24基因，提出了利用該基因進行植物花器官改造的基因工程改良方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黃瓜CsMADS24基因花特異表達載體及及其在花器官改造中的應用，該載體含有黃瓜AG-like基因CsMADS24，基因的上游連有雙35S啟動子。

?本發明的上述植物表達載體為PHB-CsMADS24，由下述方法構建而成：

（1）根據CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黃瓜CsMADS24的序列（Csa017355），設計兩端引物：CsMADS24-F：5’-?aaaaCTGCAGATGAGTTGTTATGAGGAAG-3’（含PstI位點）CsMADS24-R：5’-?aaaaTCTAGATTACACAAGTTGAAGAGAG-3’（含XbaI位點）。以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得CsMADS24全長。

（2）回收CsMADS24的cDNA全長，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-CsMADS24。

（3）使用PstI和XbaI酶切pMD18-CsMADS24，回收CsMADS24片段，同時用PstI和XbaI酶切PHB，回收后連接，轉化感受態細胞，獲得植物表達載體PHB-CsMADS24。