[發(fā)明專利]豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法及其制品

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410659633.3
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN105582535A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設計）人: 吳文福;寧宜寶;林旭埜;張毓金;岑小清;游啟有;任向陽;張國麗;丘成文;楊傲冰;賴月輝
• 申請（專利權）人: 廣東永順生物制藥股份有限公司;中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/245;A61K39/187;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，更具體是涉及到一種豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法及其制品。

背景技術

豬瘟(CSF)和偽狂犬病(PR)是危害集約化養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要傳染病，在我國豬群中廣泛存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。免疫接種是豬瘟和偽狂犬病防制的重要措施。目前應用豬瘟兔化弱毒疫苗和偽狂犬病活疫苗對這兩種疫病的防制起了很大的作用。但豬用疫苗品種很多，在實際操作中，多針次、多劑量、多種免疫程序難以合理安排，既繁瑣、費時、費力、增加成本，且容易造成漏種，直接影響預防效果。采用多聯(lián)(或多價)疫苗免疫接種，以達到預防多種傳染病的目的。同時，這兩種疫病采取的免疫程序比較接近，這為豬瘟與偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的研制提供了可能。為了達到一次免疫可有效預防和控制CSF與PR兩種疫病的發(fā)生與流行，減輕免疫接種的工作量，減少免疫次數(shù)，避免因頻繁免疫所造成的免疫麻痹，相應減少了對豬群的應激。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種克服上述缺陷的豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗及其制備方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供一種豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，包括如下步驟：

(1)用細胞轉瓶或生物反應器培養(yǎng)豬瘟病毒弱毒株、偽狂犬病病毒弱毒株；

(2)分別收獲所述步驟(1)得到的細胞培養(yǎng)毒液；

(3)所述步驟(2)得到的兩種細胞培養(yǎng)毒液按1:2-1:1.5的體積百分比混合，并在混合液中加入穩(wěn)定劑和抗菌素，經冷凍真空干燥得到豬瘟、偽狂犬病細胞活疫苗。

進一步地，其中所述生物反應器為TideCell微載體生物反應器，且所述生物反應器中含有微載體，所述微載體為cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2-25g/L。

進一步地，其中所述步驟(1)包括如下步驟：

(1a)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng)：所述傳代細胞經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，用細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代細胞單層；

(1b)細胞毒種的繁殖：將所述豬瘟病毒弱毒株接種至所述步驟(1a)中得到的傳代細胞單層，用細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4～5日收獲換液一次，取二收、三收細胞培養(yǎng)毒液作為生產用毒種；將所述偽狂犬病病毒弱毒株接種至所述步驟(1a)中得到的傳代細胞單層，用細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；2~3日后收獲細胞培養(yǎng)毒液作為生產用毒種；

(1c)制苗毒液的繁殖：

取所述步驟(1a)中得到的傳代細胞單層，棄去所述細胞生長液，接種含所述步驟(1b)中得到的含豬瘟病毒的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)；

取所述步驟(1a)中得到的傳代細胞單層，棄去所述細胞生長液，接種含所述步驟(1b)中得到的含偽狂犬病病毒的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。

進一步地，其中所述步驟(2)包括如下步驟：

將含豬瘟病毒的細胞維持液接種至傳代細胞單層后培養(yǎng)，接毒后5日第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液一次，收獲的毒液置于-15℃以下保存；將含偽狂犬病病毒的細胞維持液接種至傳代細胞單層后培養(yǎng)，接毒后2~3日后收獲細胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置于-20℃以下保存。

進一步地，其中所述步驟(1a)、(1b)、(1c)中的細胞培養(yǎng)所用的溫度為36℃~37℃。

進一步地，其中所述步驟(1b)、(1c)中接種時的接種量按體積百分比計為含1%～2%生產用細胞毒種的維持液。

進一步地，其中所述步驟(1a)中的細胞生長液含90%～92％MEM液、8%～10％犢牛血清和100~200單位/ml青鏈霉素，所述細胞生長液的pH值為7.0～7.2，其中MEM液和犢牛血清的單位為體積百分比。

進一步地，其中所述步驟(1b)和(1c)中的細胞維持液含95%～98％MEM液、2%～5％犢牛血清和100~200單位/ml青鏈霉素，所述細胞維持液的pH值為7.2～7.4，其中MEM液和犢牛血清的單位為體積百分比。

進一步地，其中所述傳代細胞為牛睪丸細胞、雞胚成纖維細胞、豬睪丸傳代細胞ST、豬腎傳代細胞PK15或豬腎傳代細胞IBRS-2。

進一步地，其中所述生物反應器的設定參數(shù)為：pH6.5-7.8、溫度36℃~37℃、溶氧30-80%、攪拌速度30-100rpm。

進一步地，其中所述生物反應器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細胞的密度為每天0.5-5個工作體積。