[發(fā)明專利]豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法及其制品

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410659633.3
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN105582535A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳文福;寧宜寶;林旭埜;張毓金;岑小清;游啟有;任向陽;張國麗;丘成文;楊傲冰;賴月輝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東永順生物制藥股份有限公司;中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/245;A61K39/187;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟病毒弱毒株、偽狂犬病病毒弱毒株；

(2)分別收獲所述步驟(1)得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液；

(3)所述步驟(2)得到的兩種細(xì)胞培養(yǎng)毒液按1:2-1:1.5的體積百分比混合，并在混合液中加入穩(wěn)定劑和抗菌素，經(jīng)冷凍真空干燥得到豬瘟、偽狂犬病細(xì)胞活疫苗。

2.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器為TideCell微載體生物反應(yīng)器，且所述生物反應(yīng)器中含有微載體，所述微載體為cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2-25g/L。

3.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)包括如下步驟：

(1a)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：所述傳代細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，用細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成傳代細(xì)胞單層；

(1b)細(xì)胞毒種的繁殖：將所述豬瘟病毒弱毒株接種至所述步驟(1a)中得到的傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4～5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；將所述偽狂犬病病毒弱毒株接種至所述步驟(1a)中得到的傳代細(xì)胞單層，用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；2~3日后收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；

(1c)制苗毒液的繁殖：

取所述步驟(1a)中得到的傳代細(xì)胞單層，棄去所述細(xì)胞生長液，接種含所述步驟(1b)中得到的含偽狂犬病病毒的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。

4.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)包括如下步驟：

將含豬瘟病毒的細(xì)胞維持液接種至傳代細(xì)胞單層后培養(yǎng)，接毒后5日第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液一次，收獲的毒液置于-15℃以下保存；將含偽狂犬病病毒的細(xì)胞維持液接種至傳代細(xì)胞單層后培養(yǎng)，接毒后2~3日后收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置于-20℃以下保存。

5.如權(quán)利要求3所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1a)、(1b)、(1c)中的細(xì)胞培養(yǎng)所用的溫度為36℃~37℃。

6.如權(quán)利要求3所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1b)、(1c)中接種時的接種量按體積百分比計為含1%～2%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持液。

7.如權(quán)利要求3所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1a)中的細(xì)胞生長液含90%～92％MEM液、8%～10％犢牛血清和100~200單位/ml青鏈霉素，所述細(xì)胞生長液的pH值為7.0～7.2，其中MEM液和犢牛血清的單位為體積百分比。

8.如權(quán)利要求3所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1b)和(1c)中的細(xì)胞維持液含95%～98％MEM液、2%～5％犢牛血清和100~200單位/ml青鏈霉素，所述細(xì)胞維持液的pH值為7.2～7.4，其中MEM液和犢牛血清的單位為體積百分比。

9.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述傳代細(xì)胞為牛睪丸細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、豬睪丸傳代細(xì)胞ST、豬腎傳代細(xì)胞PK15或豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2。

10.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器的設(shè)定參數(shù)為：pH6.5-7.8、溫度36℃~37℃、溶氧30-80%、攪拌速度30-100rpm。

11.如權(quán)利要求1所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì)胞的密度為每天0.5-5個工作體積。

12.一種豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗，其特征在于，所述豬瘟、偽狂犬病二聯(lián)活疫苗通過權(quán)利要求1-11任一所述的方法制得。