[發明專利]一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其制備方法

在審

• 申請號: 201410657429.8
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104450772A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 楊永華;趙胡;戚金亮;吳鳳瑤;朱煜;楊榮武;龐延軍
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

1.一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，其特征是硬紫草轉LeMYC基因毛狀根株系。

2.根據權利要求1所述藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系的制備方法，其特征是由以下步驟構成：

(1)提取在M9紫草寧色素生產培養基上紫草細胞總RNA并反轉錄為cDNA作為模板，通過RACE技術克隆出具有bHLH結構域的LeMYC轉錄因子基因的全長序列。高保真酶擴增目的基因LeMYC，將獲得的目的片段與真核表達載體pEGAD-eGFP連接，將連接產物用凍融法轉化發根農桿菌ATCC15834感受態細胞，挑取陽性克隆；

(2)將硬紫草種子表面清洗干凈，低溫浸泡在自來水中兩天，此間換水2-3次，然后用濕砂和種子混勻后放入4℃冰箱層積處理1個月，種子出芽后，用自來水沖洗掉沙子，用0.1％升汞消毒發芽的種子5分鐘，然后用無菌水沖洗5-7次，將水空干接種在1/2MS無激素的固體培養基上于25℃，16小時光照8小時暗培養2周，待幼苗長至2-4cm高度并伸展出第2-3對真葉時用作被侵染材料；

(3)轉基因侵染菌液制備：挑取陽性克隆菌落，用YEB液體培養基擴增至OD600＝0.8時，添加乙酰丁香酮，作為轉基因侵染菌液；

(4)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用無菌針浸蘸上述活化的具有侵染特性的菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對真葉的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖節處一下，共穿刺2-3次，然后將侵染的幼苗轉移到MS固體培養基上于25℃弱散射光培養。針刺一周即可發現侵染部位出現白色突起，隨后在侵染部位的白色突起首先變成絨毛狀，然后長出一條或多條白色的毛狀根，將誘發的毛狀根從侵染點部位剪切下來，培養在含有頭孢霉素500mg/L的B5培養基上，每周轉接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素B5培養基上培養；

(5)硬紫草轉基因毛狀根的培養：將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培養，將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基擴大培養；

(6)轉基因毛狀根分子鑒定：取野生型和預計為轉基因毛狀根材料提取其DNA作為模板，運用PCR方法同時檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因，判斷是否為硬紫草轉基因毛狀根；

(7)紫草寧合成及測定：將鑒定的轉基因紫草毛狀根經B5液體生長培養15天后轉入M9生產紫草寧液體培養基，置于26℃黑暗培養，一周后紫草寧含量即可達到很高濃度，用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根即不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。